直接抗人球蛋白试验阳性患者血型鉴定及交叉配血试验分析

周建明，曹志林

(四川省乐山市人民医院输血科，四川 乐山 614000)

直接抗人球蛋白试验(DAT)主要对人体红细胞表面中IgG、补体C3等不完全抗体检测，抗人球蛋白与不完全抗体结合时，造成红细胞聚集，此时判断为DAT阳性[1]。DAT阳性患者血清中能检测到自身抗体，输血时若自身红细胞被吸附，或存在致敏特性，则会造成血型鉴定异常，正反定型不符，促使交叉配血凝聚[2，3]，是导致交叉配血不合的重要因素。临床上RhD血型鉴定、交叉配血试验等被认为是保证输血安全的重要前提[4，5]。由于DAT检测溶血性疾病患者自身抗体在基层医院中比较少见，易造成新生儿溶血症漏诊，耽误治疗时机。为此构建并推广DAT检测及血清学特性检测方法至关重要。本研究探讨DAT阳性患者血型鉴定、交叉配血试验结果，为临床患者安全输血提供解决思路。

1 对象与方法

1.1研究对象2017年6月至2018年6月我院确诊的DAT阳性患者54例，经血常规等相关检查诊断为自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)，相关资料完整。男20例，女34例；年龄14～78岁[(47.69±7.54)岁]；其中原发性AIHA 23例，继发性AIHA 31例(恶性肿瘤11例，系统性红斑狼疮9例，慢性淋巴细胞白血病6例，淋巴瘤5例)。

1.2方法

1.2.1DAT 新鲜血液标本经压积配置为1%红细胞，备用。解开抗人球蛋白反应卡，取备用红细胞悬液50 μl注到反应卡微柱管中，配套离心机上离心10 min，结果观察。红细胞滞留于凝胶上端或中上部时判断为DAT阳性，且根据红细胞滞留部位、凝胶背景情况进一步分为4+、3+、2+、1+、W+共5个等级；若红细胞彻底沉到凝胶介质底部时判断为ADT阴性。

1.2.2交叉配血试验 凝聚胺交叉配血，试剂选用合肥天一生物技术研究所的产品，操作如下：先离心血液标本，将生理盐水与红细胞混合配制成1 ml红细胞悬液(3%～5%)，共2份；准备好2支有标记(主侧、次侧)的试管，将受血者2滴血清(浆)、供血者1滴3%～5%红细胞悬液加入主侧试管；受血者1滴3%～5%红细胞悬液、供血者2滴血清(浆)加入次侧试管；于试管中加入0.65 ml低离子介质溶液，混合均匀后静置1 min；随后加入2滴凝聚胺溶液，混合均匀后静置15 s，离心，速率为每分钟3400 rpm，共10 s；舍弃上清液，保持管底留有0.1 ml左右液体，轻摇试管，观察红细胞有无凝块，若没有则需重新操作，直到凝集现象出现停止；然后将2滴重悬液加入管中，轻轻摇动试管混合并同时观察结果，若凝集现象于1 min内散开，提示该凝集现象是由凝聚胺引起的非特异性凝集，配血结果相合；若1 min内不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，配血结果不相合。另外，对疑难交叉配血行冷抗体吸收试验、乙醚放散试验或自身抗体吸收试验等，以指导交叉配血。

2 结果

2.1DAT阳性凝集情况54例AIHA患者DAT均阳性，W+(弱凝集)17例(31.48%)，1+16例(29.53%)，2+ 20例(37.04%)，3+ 1例(1.85%)。

2.2血型鉴定54例DAT阳性患者中发生ABO血型正反定型不符43例(79.63%)，观察到患者自身红细胞、血清凝集33例(61.11%)，提示患者红细胞内有自身抗体，需深入分析。先冷抗体吸收试验，再开展乙醚放散试验，最终确定血型：A Rh阳性13例(30.23%，13/43)，B Rh阳性12例(27.91%，12/43)，O Rh阳性9例(20.93%，9/43)，AB Rh阳性9例(20.93%，9/43)。

2.3交叉配血检测结果54例DAT阳性患者中显示配血不合44例(81.48%)，其中主、次侧均显示阳性反应22例(50.00%，22/44)，主侧阳性反应、次侧阴性反应14例(31.82%，14/44)，主侧阴性反应、次侧阳性反应8例(18.18%，8/44)。因冷抗体因素造成配血不合17例(38.64%，17/44)，因冷凝集素效价1∶256以上造成配血不合8例(18.18%，8/44)，因冷凝集素效价1∶128造成配血不合19例(43.18%，19/44)。

2.4交叉配血不合处理结果对44例交叉配血不合患者行冷抗体吸收试验、乙醚放散试验、自身抗体吸收试验，最终发现交叉配血相合36例(81.82%，36/44)，仍存在交叉配血不合8例(18.18%)。

3 讨论

DAT在鉴别诊断溶血性贫血，指导输血上有重要作用[6]，其中DAT主要对原发性AIHA、溶血症等疾病诊断提供依据。DAT阳性指的是患者红细胞表面存在不完全抗体或补体，其原因包括[7，8]：①红细胞上的自身抗体影响；②接受输血的对象血液内存在同种抗体，和献血对象红细胞上抗原产生反应；③献血对象血浆与红细胞制品等之间存在同种抗体，和接受输血的对象红细胞抗原产生反应；④母亲血液内同种抗体经由胎盘附着于胎儿红细胞膜；⑤高球蛋白血症等非特异性吸附蛋白于红细胞表面包被；⑥补体将自身抗体、同种抗体等激活，促其于红细胞表面附着。本研究以54例AIHA、DAT阳性患者为研究对象，结果显示DAT阳性凝集强度以中弱凝集为主，W+至2+占98.15%，与相关报道结果一致[9，10]。

有研究显示DAT阳性患者体内有自身抗体，易造成自身红细胞致敏，对红细胞吸附，促使抗红细胞抗体产生[11]。一旦DAT阳性患者进行输血时，因为自身抗体对患者本身、他人红细胞有不同程度的凝集作用，致使ABO、Rh疑难血型鉴定难度大，同时也会影响交叉配血试验难度，特别是部分患者存在同种抗体，增加交叉配血难度。本研究54例DAT阳性患者中发生ABO血型正反定型不符43例，不符率79.63%，自身红细胞、血清凝集率61.11%，可见患者多存在自身抗体。自身抗体有冷抗体与温抗体之分，前者多在人体血清中分布，以IgM型常见，效价比较低。一旦感染、冷凝集综合征等出现，患者血清冷抗体效价便会上升，常温条件患者自身冷抗体也能和自身红细胞反应，影响血型鉴定及交叉配血。后者通常在AIHA患者中呈现强致敏性，影响交叉配血。本研究对43例患者先行冷抗体吸收试验，后行磷酸氯喹放散试验，最终对血型确定。

目前临床用于交叉配血试验的方法主要包括凝聚胺法、抗人球蛋白微柱凝胶法等，其中凝聚胺法在临床(尤其是急诊配血中)使用时间较长，操作简单且检测结果快，凝聚胺(高价阳离子多聚物)溶解后可释放较多的正电荷，与红细胞表面负电荷发生中和反应，以减少红细胞间距，进而使正常红细胞之间发生非特异性凝集，并使IgG型抗体直接凝集红细胞[12]。加入中和液后，仅由凝聚胺引起的非特异性聚集，会因电荷中和而分散，而由抗体介导的特异性凝集则不会散开[13]。若100%的红细胞沉在微管的底部则判断结果为阴性，提示受血者与供血者配血相合。本研究结果显示交叉配血不合44例，不合率81.48%，其中主、次侧均阳性反应占50.00%，单纯主侧阳性反应占31.82%，单纯次侧阳性反应占18.18%。临床上针对主、次侧均阳性反应，需对患者红细胞洗涤3次，之后行冷抗体吸收试验，对患者自身抗体解离，之后接受不规则抗体检测与主侧配血处理，同时对乙醚放散试验后的红细胞和献血人员血浆行次侧交叉配血；对主侧阳性反应、次侧阴性反应，提示患者血清有同种抗体，对此通过红细胞(被乙醚放散试验处理后)吸收患者血清自身抗体，被吸收后的血清行交叉配血试验；针对主侧阴性、次侧阳性，提示患者红细胞有自身抗体，致敏性强或被吸附，对乙醚放散试验后的红细胞行次侧配血试验。对冷抗体因素、冷凝集素效价异常上升患者来说，先温盐水洗涤红细胞，行自身抗体吸收试验，之后根据情况行冷抗体吸收试验、乙醚放散试验。经处理后，最终显示交叉配血相合率81.82%。凝聚胺技术在交叉配血中虽然具有快速检出IgG抗体的能力，但近年来临床实践发现，凝聚胺试剂对效价较低的特异性Rh抗体有漏检的情况[14]。不同交叉配血试验方法结果不一，关于这一点有待日后通过大样本数据进一步分析。

综上，DAT阳性患者血型鉴定及交叉配血试验难度大，通过冷抗体吸收试验、乙醚放散试验或自身抗体吸收试验等合理应用，有利于血型鉴定及交叉配血进行，为输血提供准确结果，保证患者输血安全。