胶体金免疫层析法快速定量检测饲料中黄曲霉毒素B1残留

李 明 张振宇 柴 磊

（1.济源市畜产品质量监测检验中心，河南济源 459000；2.焦作市畜产品质量安全监测中心，河南焦作 454001）

黄曲霉毒素B1是迄今为止人类所知的毒性和致癌性最强的物质之一，其急性毒性约为三氧化二砷的68倍、氰化钾的10倍。随着饲料工业的快速发展，近年来，中国的饲料也受到霉菌污染的严重挑战，为了保证食品安全，保障消费者的健康，需要检测饲料中黄曲霉毒素B1。目前国内应用标准检测方法大多为仪器方法，所需仪器设备昂贵，不利于进行广泛推广，并且限制了很多检测单位高效、广泛地开展检测工作。胶体金免疫层析法快速定量法检测饲料中黄曲霉毒素B1残留具有检测快速、简便、灵敏、成本低等优点。

1 材料与方法

1.1 材料

PBS 清洗缓冲液（Charm公司）；AFB1标准液（Romer公司）；AFB1免疫亲和柱（Romer公司）；玻璃纤维滤纸（Whatman公司）；ROSA黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测条（Charm公司）。

Waters 2695高效液相色谱仪（Waters公司）；孵育器、读数仪（Charm公司）。

1.2 快速定量胶体金免疫层析法

准确称取样品5.0g试样于50ml具塞锥形瓶中，加入20ml试样提取液，密闭，振荡10min，8000 r/min离心5min，取离心后上清液100µl于另一离心管中，加 入1.0 ml稀释缓冲液，充分混匀待测。将检测条平放在分别准确量取300µl待测样品、阴性质控样品、阳性质控样品加入胶体金检测试纸条的加样孔中，放入已预热孵育器中孵育，孵育8 min后取出检测试纸条观察C线（质控线）和T线（检测线）显色情况。选择读数仪调为检测模式，把检测条放入读数仪，读数仪自动显示样品中黄曲霉毒素B1的含量。

1.3 免疫亲和柱净化HPLC法

称取样品4 g于50ml离心管中，加入10ml甲醇，振荡后静置20min，涡旋10min。置于5000r/min离心10min，过玻璃纤维滤纸后，取10 ml滤液至离心管，加入40ml PBS缓冲液，免疫亲和柱内的液体放弃后，将上述样液移至50ml注射器筒中，待样液滴完后，往注射器筒内加入10ml水淋洗免疫亲和柱。待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱，在亲和柱下放置10ml刻度试管，取下50ml的注射器筒，加入5ml乙腈洗脱亲和柱，收集全部洗脱液至刻度试管中。在50℃下氮气吹至近干，用初始流动相溶解残留物，0.22µm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶，液相色谱进样分析。

2 结果与分析

2.1 检测限

取空白豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料补充料样品各10份，添加浓度为0、2、5、10、20µg/kg，经样品前处理后进行检测，结果表明：样品添加浓度为10µg/kg时，本检测方法的测定结果均为阳性，因此可以确定该方法检测限为10µg/kg。

2.2 假阳性率

取空白豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料补充料样品各10份，5µg/kg AFB1添加浓度，经样品前处理后进行检测，统计假阳性数，检测阴性样品结果显示：本检测方法样品检测的假阳性率为0。

2.3 假阴性率

取10µg/kg AFB1添加的豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料补充料样品各10份，20µg/kg AFB1添加各10份，经样品前处理后进行检测，检测阳性样品结果显示：本检测方法对样品检测的假阴性率为0。

2.4 特异性

选择饲料中常检出的真菌毒素，对空白样品进行添加测定，通过阴阳性来判断检测方法的特异性。在空白豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料补充料样品中分别添加2µg/kg、5µg/kg、10µg/kg、20µg/kg、500µg/kg黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、T-2毒素、伏马毒素，经样品前处理后进行检测，样品中黄曲霉毒素B1添加浓度≥10µg/kg时，检测结果呈阳性，其他真菌毒素的检测结果均为阴性。说明本检测方法可特异性地检测黄曲霉毒素B1，而对其他真菌毒素无特异性反应。

2.5 实际样品检测中两种方法比对

抽取花生粕、奶牛精料补充料样品共20份，用胶体金免疫层析法和仪器方法分别进行检测。仪器方法参考GB/T 30955-2014《饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱》，结果表明其中17个样品呈阴性，两种方法检测黄曲霉毒素B1含量均未检出，另3个样品呈阳性，两种方法均有检出，相对偏差的计算是以高效液相色谱测定值为参考值，两种方法的最大相对偏差为15.1%，其结果具有一致性。

3 结论

用胶体金免疫层析方法初步筛查饲料原料中黄曲霉毒素B1的方法满足对黄曲霉毒素B1满足对黄曲霉毒素B1限量要求。胶体金免疫层析法快速定量法检测饲料中黄曲霉毒素B1残留具有检测快速、简便、灵敏、成本低等优点，可作为一种快速筛查方法，当筛查出高于检测限的阳性样品时，须采用相关液相、液质分析方法进行确证。