Cullin7蛋白在原发性肝癌癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

林 兰， 李 乾

(海口市人民医院病理科， 海口 570208)

原发性肝癌是肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿，己成为全世界癌症死亡的重要原因，严重威胁人类健康[1-2]。全球每年新增原发性肝癌患者900万左右。我国每年新增原发性肝癌患者400万左右，其中70%的原发性肝癌由乙肝引起，其次为丙肝及饮酒，黄曲霉毒素是我国南方潮湿地区原发性肝癌发病的高危因素，患者常因肝区疼痛(刺痛或胀痛、持续性钝痛)而就诊，约三分之二就诊时已处于晚期，其治疗手段以手术为主，结合分子靶向治疗、化疗、放疗。但若原发性肝癌已扩散，或对放疗化疗不敏感，其手术效果往往不佳，五年生存率较低(约17.6%)，因此探讨原发性肝癌的发病机制具有重要意义[3-5]。Cullin7定位于6p21.1, 由1 698个氨基酸组成，有高度保守的Cullin结构域，在胎盘、胎儿肾脏，骨骼肌肉、脾脏、肾脏、心脏正常表达，对胚胎发育、免疫系统调控、血管生成和肿瘤转移等方面发挥着重要作用[6]。Cullin7是E3泛素连接酶复合物的组件，通过连接赖氨酸48与靶蛋白多聚泛素链共价结合，进而启动对后续基因蛋白的调控，若Cullin7基因突变后，Cullin7蛋白空间构象发生改变，其细胞内泛素水平失衡，细胞生长、凋亡和DNA 修复紊乱，导致细胞恶性增殖[7-9]。目前关于Cullin7蛋白与原发性肝癌关系的研究较少，因此本研究拟探讨Cullin7蛋白在原发性肝癌癌组织中的表达及临床意义，为原发性肝癌的治疗提供理论及临床依据。

1 资料与方法

1.1一般资料2011年3月-2014年4月在海口市人民医院肝胆外科行手术治疗并经病理证实的原发性肝癌患者130例，年龄为40～74岁，平均(57.5±17.8)岁, 男性65例,女性55例，甲胎蛋白≤200 μg/L者85 例，甲胎蛋白>200 μg/L者45例，平均(189.67±108.92) μg/L，天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)(15.7～100.6) U/L，平均(56.4±45.9) U/L；谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)( 15.87～157.90) U/L，平均(78.9±69.4) U/L；乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBs Ag)阳性109例，HBs Ag阴性21例；病程为9个月～4年；门静脉癌栓者89例，无门静脉癌栓者41例；肿瘤个数为单发者25例，肿瘤个数为多发者105例；肝细胞癌97例、胆管细胞癌23例、混合细胞癌10例。符合美国国家综合癌症网(National Compre-hensive Cancer network，NCCN)公布的2005版《Occult Primary Cancer Clinical Practice Guidelines》中关于原发性肝癌的诊断标准[10]。病理分期采用中国抗癌协会肝癌专业委员会2001年修订的原发性肝癌分期标准。术切除标本后行病理检查以判定Cullin7蛋白与浸润深度、淋巴结转移、TMN分期、复发、淋巴血管间隙浸润、病理学分级、肿瘤最大径的相关性。同时取距原发性肝癌组织5 cm以上的正常肝脏组织为癌旁组。患者自愿提供正常肝脏组织及原发性肝癌组织标本，用于分析Cullin7蛋白的表达。纳入标准：入选患者均符合美国国家综合癌症网2005版《Occult Primary Cancer Clinical Practice Guidelines》中关于原发性肝癌的诊断标准；临床资料完整、详细；患者(或患者直系亲属)均签署知情同意书。 排除标准：入院前接受放化疗治疗的其他恶性肿瘤患者；心功能不全、膜性心脏病以及急诊冠状动脉介入治疗者；肝、肾、心功能异常者；预计存活期<3个月。

1.2主要仪器和试剂免疫组织化学二抗试剂盒、抗体稀释液、DAB显色试剂盒均购于南京森贝伽生物科技有限公司，北京永光明SW-CJ-1D超净工作台(北京市永光明医疗仪器有限公司)，Cullin7一抗(购于上海源叶生物科技有限公司)，Cullin7 酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)试剂盒(购于武汉伊艾博科技有限公司)，南京德铁HBS-1096A 酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)。

1.3ELISA测定Cullin7蛋白水平实验开始前所有器具高压灭菌，37℃烘干。将保存在液氮罐中的正常肝脏组织、原发性肝癌组织取出。准确称取0.5 g正常肝脏组织,原发性肝癌组织,加入0.5 mL 0.9%生理盐水，在高速粉碎仪(10 000 r/s)中迅速将其粉碎至粘液状；将组织粘液转入2 mL Eppendorf管中，加入1.2 mL PBS(pH7.4)，充分振荡混匀，室温静止30 min后以2 000 r/min，4℃，离心10 min。仔细收集上清液。获取正常肝脏组织、原发性肝癌组织上清液后，采用ELISA检测正常肝脏组织、原发性肝癌组织的Cullin7蛋白表达量。

1.4Cullin7在正常肝脏组织、原发性肝癌组织表达水平的测定免疫组织化学法测定Cullin7在正常肝脏组织、原发性肝癌组织中的表达。随机选取10个高倍视野(×400)计数，从阳性率最高的部位开始，无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，同时计数；>50%为(+++)，26%～50% 为 (++)，6%～25% 为 (+)，阳性细胞≤5% 为 (-)，(-)及(+)归为不表达组或低表达组即为阴性，(++)及(+++)归为高表达组即为阳性，所有病理标本制作由同一名病理科医师完成，而免疫组织化学法结果的判定则采取双盲法评估。设立阳性对照(用DAKO公司生产的一抗作为阳性对照，染色结果作为标准结果)，阳性颗粒定位于细胞核，呈均匀分布或位于核膜下，有的呈小斑块状不规则分布。具体制片过程为：常规制作5 μm的正常肝脏组织、原发性肝癌组织石蜡切片，3% 的H2O2液常温阻断内源性过氧化氢酶活性，微波修复抗原，PBS常规冲洗，1% 的Cullin7抗体工作液(稀释浓度1∶200)(购于英国Abcam公司)，4℃夜，加入二抗(IgG)，室温30 min，加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，(50%、60%、80%、90%、95%、100%)梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。

1.5随访随访起始日期为术后第1天，随访截止日期为 2018年1月1日。随访方式为入户随访，随访内容为：治疗效果、恢复情况、病情变化、生存质量等。

2 结果

2.1癌旁组、原发性肝癌组中Cullin7蛋白水平的表达原发性肝癌组Cullin7蛋白表达水平高于癌旁组(t=170.644，P<0.001)，见表1。

表1 癌旁组、原发性肝癌组中Cullin7蛋白水平的表达

表1 癌旁组、原发性肝癌组中Cullin7蛋白水平的表达

组别例数Cullin7/(ng/g)癌旁组13029.87±8.96原发性肝癌组130198.76±6.86t值170.644P值<0.001

2.2癌旁组、原发性肝癌组中Cullin7表达的相关性分析Cullin7主要定位于胞核，其阳性表达为棕褐色，见图1。原发性肝癌组Cullin7阳性率高于癌旁组(χ2=115.535，P<0.01)，见表2。

表2 不同临床病理特征组中Cullin7表达的相关性分析/例(%)

2.3Cullin7蛋白表达与临床病理特征的关系Cullin7蛋白表达与年龄相关性不明显(χ2=3.211，P>0.05);与浸润深度、淋巴结转移、TMN分期、复发、淋巴血管间隙浸润、病理学分级、肿瘤最大径有关，且浸润深度越深、有淋巴结转移、TMN分期越高、有复发、有淋巴血管间隙浸润、病理学分期越高、肿瘤最大径≥5 cm，Cullin7蛋白阳性表达率越高(χ2=19.238、37.717、20.512、23.662、15.331、20.910、15.455，P<0.05),见表3。

2.4Cullin7蛋白表达水平与原发性肝癌患者预后分析Cullin7阴性组3年生存率及生存期均明显高于Cullin7阳性组(χ2=34.592,Z=19.764，P<0.05),见表4、图2。

表3 Cullin7蛋白表达与临床病理特征的关系/例(%)

3 讨论

Cullin7-RING复合体组是E3连接酶组的重要组成部分，Cullin7可靶向定位目标分子并与结合酶的ROCl RING域形成同源二聚体，形成Skpl-CULl-Fbox蛋白-ROCl复合体，而Cullin7的C-末端的cullin域会招募结合酶(Cdc34、Ubc4、E2)催化向底物分子蛋白转移，进行泛素化。若Cullin7过表达，Aurora A活性增强，泛素化过程受阻，而Akt/RAS/MEK/ERK信号通路激活，细胞增殖、凋亡、分化、转移及损伤修复功能紊乱，导致细胞恶性转化[11-13]。本研究显示，原发性肝癌组Cullin7阳性率高于于癌旁组，原发性肝癌组Cullin7水平高于癌旁组，这与上述结论一致。国内外研究已证实，Cullin7能明显促进肿瘤的发生、发展、转移。Cullin7能促进E-cadherin酶的表达，E-cadherin酶是一种分泌型铜依赖性胺氧酶，能降解细胞外弹力蛋白和基质胶原交联，促进肿瘤细胞增殖和侵袭迁移，此外Cullin7能强烈抑制细胞凋亡，肺癌细胞中的Cullin7表达水平远远高于野生株，而Cullin7水平的高表达意味着肿瘤细胞黏附于血管内皮细胞的能力加强，这样才能穿过细胞外基质层，建立远处转移灶[14-15]。本研究中，Cullin7表达水平与浸润深度、淋巴结转移、TMN分期、复发、淋巴血管间隙浸润、病理学分级、肿瘤最大径相关性明显，且浸润深度越深、有淋巴结转移、TMN分期越高、有复发、有淋巴血管间隙浸润、病理学分期越高、肿瘤最大径≥5 cm，Cullin7蛋白阳性表达率越高。与上述讨论符合，也说明Cullin7在原发性肝癌的发生、发展、远处转移过程中起促进作用。

表4 Cullin7蛋白表达水平与原发性肝癌患者预后分析

图2 Cullin7阳、阴组 Kaplan-Meier生存曲线分析

Cullin7蛋白能促进细胞肿瘤因子白介素-8、血管内皮生长因子的分泌，而白介素-8、血管内皮生长因子能明显增强肿瘤血管系统的生长，并强烈刺激肿瘤实体的形成。本研究中，通过预后分析，Cullin7阴性组3年生存率及生存期均明显高于Cullin7 阳性组，证实了这一点。此外，研究发现Cullin7可介导癌细胞的定向转移和趋化性，并激活淋巴细胞、内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞上相应的趋化因子受体，并激活WNT信号通路(wingless/integrated，WNT)，将细胞质中的β-连环蛋白(β-catenin)主动转运至细胞核中，与TCF/LEF的同源异构区域结合，导致靶基因过度表达，进而导致细胞凋亡机制失衡，细胞大量增殖，发生癌变，形成恶性表型[16-18]。

综上所述，Cullin7在原发性肝癌的发生、发展过程中起促进作用；Cullin7蛋白在原发性肝癌癌组织中表达量增加，Cullin7蛋白低表达的原发性肝癌患者能获得较好的预后。