清肠温中方通过miR-675-5p/VDR信号通路调控溃疡性结肠炎Th17/Treg免疫平衡及肠黏膜屏障的机制研究*

孙中美 丁庞华 王文婷 史 瑞 裴文静 郭 一 谢添弘 姜 慧 石 磊 原文静 毛堂友 △ 指导 李军祥

（1.北京中医药大学东方医院，北京 100078；2.北京中医药大学，北京 100029；3.北京市羊坊店医院，北京 100038；4.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

溃疡性结肠炎（UC）是炎症性肠病的一种，主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便等，严重影响患者的生活质量［1］。目前UC的发病机制尚不清楚，最新研究显示，miR-675-5p/维生素D受体（VDR）信号通路失调，造成肠黏膜屏障功能受损及肠黏膜免疫紊乱，是导致UC发病的主要机制之一［2］。本课题组前期研究发现，清肠温中方能够明显改善UC患者的临床症状，抑制炎症反应，修复肠黏膜损伤，但具体机制不明［3］。因此，本研究将从miR-675-5p/VDR信号通路入手，进一步探讨清肠温中方治疗UC的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 24只健康SPF级SD雄性大鼠,体质量（180±220） g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002，饲养于北京中医药大学东方医院动物房。12 h光照/黑夜循环，温度20～24℃，湿度50%～60%；自由饮食饮水饲养。

1.2 药物 清肠温中方配方颗粒：黄连6 g，炮姜10 g，三七 6 g，青黛 6 g，地榆炭 15 g，苦参 15 g，木香 6 g，炙甘草6 g。由北京中医药大学东方医院配方颗粒药房统一购于北京康仁堂药业有限公司。

1.3 试剂与仪器 葡聚糖硫酸钠（MW36-50KDa；MP Biomedical，Burlingame，CA，USA），便潜血试纸（珠海贝索生物技术有限公司）；ZO-1抗体 （Santa cruz，SC-8146），Occludin 抗体（Abcam，Ab31721）。

1.4 分组、造模及标本采集 动物模型的建立方法如前期研究［4-5］，所有大鼠适应性饲养7 d后，称取体质量，按照随机数字表法将大鼠随机等分为3组：空白组、模型组、清肠温中方组。空白组自由饮用去离子水同时予去离子水灌胃；模型组和清肠温中方组自由饮用4.5%DSS溶液制备UC模型，同时模型组给予去离子水，清肠温中方组予清肠温中方灌胃7 d。每日称取大鼠体质量，观察大便性状，检测便潜血，计算疾病活动指数。干预结束后，禁食不禁水24 h后麻醉大鼠，取血及结肠组织，-80℃冻存备用。

1.5 结肠miR-675-5p表达检测 按照TRIzol Regent说明书提取RNA。miR-675-5p的逆转录引物为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACCAGTGTGC-3′。逆转录条件为42℃，60min，72℃5 min。逆转录获得的cDNA进行实时荧光定量PCR检测miR-675-5p的表达，以U6作为内参，引物序列见表1，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

表1 miR-675-5p及U6基因序列引物

1.6 结肠 VDR mRNA、孤核受体（RORγt） mRNA、叉头蛋白P3（Foxp3）mRNA的表达检测 提取结肠组织样本的总RNA，逆转录后进行PCR扩增，PCR产物经电泳后， 采用 2-△△CT法进行 VDR mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相对定量分析。VDR mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA 的引物如表2。

表 2 VDR、RORγt、Foxp3 基因序列引物

1.7 ELISA检测血清白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17（IL-17）的表达 应用大鼠IL-10、IL-17酶联免疫试剂盒检测大鼠血清IL-10、IL-17的浓度。

1.8 免疫组织化学检测结肠ZO-1、Occludin的表达4 μm厚石蜡切片经过脱蜡、复水、高压修复、封闭后，加入一抗（ZO-1抗体浓度1∶500，Occludin抗体浓度1∶500）、二抗，经过显色、复染、脱水、封片后，200 倍镜视野下采集图片，Image pro plus 6.0软件分析图像，计算光密度和染色区域总面积，用平均光密度（IOD/area）来进行统计分析。

1.9 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，符合正态分布且方差齐进行单因素方差分析（One-way ANOVA），不符合正态分布或方差不齐进行非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠结肠miR-675-5p、VDR mRNA的比较见表3。空白组第8号大鼠在实验第3天不明原因死亡，其余大鼠均耐受实验干预措施，直至实验结束。模型组大鼠结肠组织miR-675-5p的表达水平显著升高（P＜0.01），VDR mRNA 的表达水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，清肠温中方组大鼠结肠组织miR-675-5p的表达水平显著降低 （P＜0.05），VDR mRNA的表达水平显著升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠结肠miR-675-5p、VDR mRNA的比较（±s）

表3 各组大鼠结肠miR-675-5p、VDR mRNA的比较（±s）

与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同

组别 n miR-675-5p VDR mRNA空白组 7 1.762±0.577 4.173±1.600模型组 8 3.182±0.907△△ 2.570±0.924△清肠温中方组 8 1.832±0.853* 3.973±1.217*

2.2 各组大鼠结肠 RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的比较 见表4。与空白组比较，模型组大鼠结肠组织RORγt mRNA的表达水平明显增高 （P＜0.05），而Foxp3 mRNA的表达水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，清肠温中方组大鼠结肠的RORγt mRNA的表达水平明显降低（P＜0.05），而Foxp3 mRNA的表达水平显著升高（P＜0.01）。

表4 各组大鼠结肠RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的比较（±s）

表4 各组大鼠结肠RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的比较（±s）

组 别 n RORγt mRNA Foxp3 mRNA空白组 7 1.122±0.387 1.216±0.563模型组 8 1.756±0.415△ 0.592±0.210△清肠温中方组 8 1.150±0.306* 1.434±0.496**

2.3 各组大鼠血清IL-10、IL-17的比较 见表5。与空白组比较，模型组大鼠血清IL-10明显降低 （P＜0.01），而血清IL-17明显升高（P＜0.05）。清肠温中方干预后，血清IL-10明显升高（P＜0.05），而血清IL-17明显降低（P＜0.05）。

表5 各组大鼠结肠血清IL-10、IL-17的比较（pg/mL，±s）

表5 各组大鼠结肠血清IL-10、IL-17的比较（pg/mL，±s）

组 别 n IL-10 IL-17空白组 7 73.39±14.35 3.93±0.41模型组 8 43.90±8.91△△ 6.16±1.71△清肠温中方组 8 62.30±13.79* 4.14±0.20*

2.4 各组大鼠结肠ZO-1、Occludin的比较 空白组大鼠结肠组织中的ZO-1、Occludin阳性表达较多，模型组中ZO-1、Occludin阳性表达区域明显减少，经过治疗后，清肠温中方组较模型组的表达相对增强，其组织切片阳性表达染色主要为深棕黄色或褐色，见图1、图2。与空白组比较，模型组ZO-1、Occludin的平均光密度明显降低（P＜0.05）；清肠温中方治疗后，大鼠结肠的ZO-1、Occludin平均光密度较模型组显著增加（P＜0.05或P＜0.01），见表 6。

表6 各组大鼠结肠ZO-1、Occludin的比较（±s）

表6 各组大鼠结肠ZO-1、Occludin的比较（±s）

组 别 n ZO-1平均光密度 Occludin平均光密度空白组 7 0.127±0.038 0.119±0.043模型组 8 0.076±0.044△ 0.082±0.023△清肠温中方组 8 0.117±0.019* 0.117±0.014**

3 讨 论

图1 各组大鼠结肠ZO-1蛋白表达情况（IHC，200倍）

图2 各组大鼠结肠Occludin蛋白表达情况（IHC，200倍）

UC是一种病变局限于黏膜及黏膜下层的结肠及直肠的慢性非特异性炎症性疾病，典型的临床症状为黏液脓血便，其病因尚不明确［6］。本病病程较长，在身体、心理以及经济方面均对患者造成巨大的压力［7］。目前，UC的主要治疗目的是诱导缓解、维持缓解以及防止复发等方面。西医主要的治疗方法有氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、微生物制剂以及生物制剂等，但是在临床使用中存在各种问题，如氨基水杨酸制剂存在药物不良反应明显、疗程长等缺点；糖皮质激素易导致机会性感染及骨折风险升高，且存在药物依赖及药物抵抗的问题；而免疫抑制剂以及生物制剂使用过后感染及肿瘤发生的风险升高，且其目前尚在研究阶段，疗效及安全性尚不明确［8-11］。中医药辨证论治在UC的治疗中因效果显著、副作用小等优势取得了令人瞩目的成就。

清肠温中方是本文指导，北京中医药大学东方医院李军祥教授根据多年治疗UC总结的经验方，主要组成为：黄连 6 g，炮姜 10 g，青黛 6 g，苦参 15 g，三七6 g，木香 6 g，地榆炭 15 g，炙甘草 6 g。本方以黄连、炮姜为君药以清热燥湿，温脾止泻；三七、苦参、青黛为臣药以增强清热燥湿之功，并兼化瘀止血之效；以木香、地榆炭为佐药以行气导滞、凉血止血；并以炙甘草为使药以补益脾气、调和诸药。前期临床、动物实验［3-5］提示清肠温中方治疗UC疗效显著，并抑制肠道炎症反应修复肠黏膜损伤，但具体机制不明。本实验通过研究清肠温中方对DSS诱导UC大鼠Th17/Treg免疫平衡及肠黏膜屏障的影响，进一步探究其治疗UC的机制。

MiR-675-5p是长链非编码 RNA（lncRNA）H19的直接转录产物，由LncRNA H19第一外显子区编码生成的。LncRNA H19的高表达可以增加miR-675-5p的释放量，而miR-675-5p可以通过和下游靶基因VDR mRNA的3’UTR以非完全匹配方式相结合，从而干扰和抑制VDR mRNA的翻译，同时还可以通过使靶基因VDR mRNA脱腺苷酸化的作用，增强其对靶基因VDR mRNA的降解，从而降低VDR的表达［12-13］。

VDR是类固醇激素/甲状腺激素受体超家族的一员，是一类配体依赖性的转录因子，在人体中广泛表达于各类细胞。VDR一方面可特异性地与维生素D（VD）结合，调节其内生维生素D的活化形式，即维生素D-1，25（OH）2D3的水平，改变上皮通透性，促进肠黏膜屏障紧密连接蛋白ZO-1、Occludin等和黏附连接蛋白E-cadherin的表达，从而增强肠壁的屏障功能；另一方面表达于CD4+T细胞上的VDR与VD特异性结合后，从而调控Th17/Treg免疫平衡，从而维持肠黏膜免疫稳态［14-16］。

Th17/Treg免疫平衡的失调是UC发病的主要因素［17］。RORγt是促进Th17细胞分化的特异性转录因子，可诱导Th17细胞分泌IL-17等促炎因子，从而促进肠道炎症；Foxp3是Treg细胞的特性核转录因子，可调节Treg细胞的分化发育，诱导IL-10等抑炎因子的产生，二者保持动态平衡，共同维持肠黏膜免疫稳态［18-19］。当二者的免疫平衡失调后，会导致Th17细胞分泌的IL-17等促炎因子的分泌增多，Treg细胞分泌的IL-10等抑炎因子的数量减少，最终引起肠黏膜免疫紊乱，导致UC 发生［20-21］。

因此，通过调控miR-675-5p/VDR信号通路修复UC大鼠肠黏膜屏障及调控Th17/Treg免疫平衡成为治疗UC的新的方向。本次研究发现，模型组大鼠结肠miR-675-5p、RORγt mRNA 及血清 IL-17的表达较空白组明显增高，VDR mRNA、Foxp3 mRNA、ZO-1、Occludin、血清IL-10的表达较空白组明显降低，提示miR-675-5p/VDR信号通路参与了UC的发病过程，而经过清肠温中方的干预后，大鼠结肠miR-675-5p、RORγt mRNA及血清IL-17的表达较模型组明显降低， 而 VDR mRNA、Foxp3 mRNA、ZO-1、Occludin、血清IL-10的表达较模型组明显升高，表明清肠温中方可以通过降低miR-675-5p的表达，靶向调控VDR信号通路，从而调控UC Th17/Treg免疫平衡、修复肠黏膜屏障损伤，达到治疗UC的目的。

本次研究通过动物实验探讨了miR-675-5p/VDR信号通路促进大鼠UC发病的分子机制，对清肠温中方治疗UC的作用机制做了进一步探讨，但中药治疗疾病的机制往往是多方面的，更深、更广的作用机制有待于更深层次的研究。