告达庭衍生物抑制人乳腺癌细胞迁移和血管生成作用研究

金湛 甘椿椿 陈高 胡高波 姚水洪

【关键词】告达庭;血管生成

乳腺癌是世界三大最常见癌症之一，并且是女性发病率最高的肿瘤。据最新统计，2012年全球约有1700万人被诊断患有乳腺癌，而每年约有50万死于乳腺癌。2018年全球乳腺癌新增病例占所有癌症的11.6%，与肺癌并列第一，死亡人数多达62万余人。所以乳腺癌的诊断和治疗显得尤为重要。目前对乳腺癌的治疗手段主要有手术、放疗、化疗和内分泌治疗等，早期诊断出乳腺癌一般可以治愈，然而乳腺癌仍是导致死亡的重要罪魁祸首，原因可能是由于生活方式改变和缺乏先进的诊断和治疗手段。因此寻找和开发新的、低毒高效的治疗乳腺癌药物已刻不容缓。

从天然产物中发现新的药物是新药开发项目中的常见的策略，而且有很多药物都是基于这一方式发现的，如紫杉醇、喜树碱、吗啡等。白首乌为萝摩科鹅绒藤属植物耳叶牛皮消（Cynanchumau-riculatumRoyle ex Wight）的干燥块根，是传统的补益中药。中国长期以来自首乌通常被用作功能性食品和滋补剂，常规治疗功效如补肝肾、强筋骨、黑须发及延年益寿等。现代药理研究表明，自首乌具有多种药理作用，包括抗衰老、抗炎、抗肿瘤，抗氧化，免疫调节，保肝和脂质调节作用等。C21甾体苷类化合物通常被认为是自首乌的主要活性成分，研究表明其具有显著抗肿瘤活性，从自首乌中分离得到的C21甾体苷元告達庭（Caudatin）对人多种肿瘤都具有显著抑制作用，如胃癌、肝癌、肺癌等。然而在生物体中告达庭通常是以糖苷的形式存在，在我们前期研究中发现告达庭衍生物，告达庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷（3-O-β-D-cymaropyranoside）对乳腺癌生长具有良好抑制作用。本研究在前期研究基础上继续探讨告达庭3-O-β-D-加拿大麻糖苷是否对乳腺癌细胞转移能力具有抑制作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株：人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2药物：告达庭3-O-β-D-加拿大麻糖苷（Ca-G）自制，纯度>98%，配制成10mg/ml的母液，溶剂为DMSO，于-20℃分装保存。

1.1.3试剂：DMEM培养液、胎牛血清购自美国Invitrogen公司;MTT、DMSO购自美国Sigma公司;H&E染色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司;anti-cyclin Dl，anti-β-tubulin购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养：人乳腺癌细胞株MDA-MB-231培养于含10%胎牛血清的完全DMEM/F12培养基中，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，密度达90%左右时进行传代。

1.2.2MTT法测定细胞活力：收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，经胰酶消化并离心后，调整细胞悬液浓度，以3×103个/孔的密度接种于96孔培养板，每孔100μL。置于37℃、5%co恒温培养箱中培养24 h，待细胞贴壁完全后，加入不同浓度的Ca-G，浓度梯度设置为2.5，5，10，15μg/mL，另外设置溶剂对照组（不加药，加入DMSO）和空白调零组（只加培养液、不加细胞和药物），均设4个复孔，继续培养24h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL，孵育4h，吸净孔内液体，每孔加入150μL的DMSO，震荡10min，使蓝紫色结晶物甲瓒充分溶解，用酶标仪于570nm处测各孔吸光度（OD）值，并计算相对细胞存活率。相对细胞存活率（%）=（给药孔-空白调零孔/对照孔-空白调零孔）×100%。

1.2.3创口愈合：收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，经胰酶消化并离心后，调整细胞悬液浓度，接种于6孔培养板中，细胞密度为6×105个/皿，置于37℃、5%C02的培养箱中培养。待细胞贴壁90%以上后，用200 μ1枪头沿灭菌尺垂直于孔板制造细胞划痕。小心吸去细胞培养基，用PBS洗3遍以洗去划痕产生的细胞碎片。更换成无血清培养基培养，使细胞处于饥饿状态，并加入不同浓度梯度药物（0，5，10μg/mL）。分别于划痕0，12，24 h在显微镜下拍照记录创口愈合情况，运用ImageJ软件计算创口愈合间距和相对创口愈合率（即细胞相对迁移率）。

1.2.4Transwell迁移实验：收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，经胰酶消化并离心后，调整细胞悬液浓度为5×105个/ml。在Transwell小室下室加入500μl含不同药物浓度（0，5，10μg/mL）的10%FBS的完全培养基。上室加入取100μl细胞悬液。将细胞置于37℃，5%co2及饱和湿度的细胞培养箱中孵育。18h后终止培养，取出小室。用甲醇固定，苏木素和尹红各染5min，冲去残余的染料。Transwell小室在正置显微镜下观察，计算细胞相对迁移率。

1.2.5 westernblot：收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，经胰酶消化并离心后，调整细胞悬液浓度，接种于6 cm的培养皿中。待细胞贴壁完全后，加入不同浓度药物（0，5，10μ/mL），培养箱中孵育24 h后，收集各组细胞。加入适量RIPA裂解液裂解。按照碧云天BCA蛋白含量测定试剂盒说明书检测样品蛋白含量，并进行SDS-PAGE电泳、转膜，封闭，孵育一抗，过夜。并加入二抗，按照ECL显影液试剂盒说明书，放人化学发光成像系统，曝光。

1.2.6统计学分析：采用SPSS 12.0软件进行统计分析，各组数据用均数±标准差（π±s）表示。组间均数的比较均采用t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001具有统计学意义。

2结果

2.1 Ca-G对乳腺癌细胞活力的影响如图1所示，MTT结果显示不同浓度的Ca-G给药24 h后，15μg/mL加药组乳腺癌细胞株的活力明显降低，而在15μg/mL以下浓度基本无细胞毒作用，故在接下来的实验中选用5，10μg/mL的浓度作为实验浓度。

2.2 Ca-G对细胞迁移的影响在Ca-G非细胞毒剂量下本研究检测了Ca-G对乳腺癌细胞迁移的作用，创口愈合实验结果如图2所示，Ca-G能明显抑制MDA-MB-231细胞向中心迁移，结果说明药物在一定程度能够抑制MDA-MB-231细胞迁移。而Transwell迁移实验结果同样显示，在加入Ca-G后，从上室穿到下室的细胞量明显减少，说明细胞的迁移率明显下降，以上结果均表明Ca-G能够抑制MDA-MB-231细胞迁移。

2.3 Ca-G對血管生成关键蛋白表达水平的影响大多数肿瘤细胞可产生血管内皮生长因子（VEGF），VEGF一般被认为是参与肿瘤生长最有效的血管生成因子。VEGFR的活化可导致下游信号通路的激活，如磷酸肌醇3-激酶（P13K）/蛋白激酶B（AKT），粘着斑激酶（FAK）。在本研究中，对Ca-G的抗血管生成作用及潜在机制进行了研宄，结果显示，Ca-G作用后，VEGF、AKT、FAK蛋白表达均有所下降。结果表明，Ca-G通过抑制VEGF/AKT/FAK信号通路显著抑制乳腺癌细胞血管生成，结果如图3所示。

3讨论

中药，由于其特殊的药理活性、低毒性和不易产生耐药等特点，在癌症治疗中呈现出良好的研究与应用前景。自首乌中C21甾体苷在体内外研究中，均具有良好的抑制肿瘤作用，告达庭作为其中一种苷元也起到一定抗肿瘤作用，但是其在自首乌中的含量较低。告达庭3-O-β-D-加拿大麻糖苷（Ca-G）是以告达庭为苷元形成的一种糖苷类化合物。很少报道其是否具有抗肿瘤作用。课题组前期研究结果发现Ca-G能够剂量依赖性地抑制乳腺癌细胞的增殖，能够抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞内cyclin D1的表达，可能与阻滞细胞周期GO/G1期相关。

对于恶性肿瘤，除了表现无限繁殖特征，并且能够进行局部浸润和远端转移，随着进一步恶化，可渗入周围的血管和淋巴管，肿瘤细胞会从这些血管和淋巴管中逃脱，从而进入远端组织的薄壁组织，在这个过程中不断地为肿瘤提供必需的营养物质，从而引发的新血管的形成，并帮助去除代谢废物。

细胞划痕是指在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，通过制造体外贴壁细胞创口愈合实验模型，来观察肿瘤细胞迁移能力的强弱。本研究通过创口愈合实验检测加入Ca-G后MDA-MB-231细胞的创口愈合能力。实验结果显示药物作用后MDA-MB-231细胞的创口愈合速度明显下降，说明Ca-G一定程度可以抑制乳腺癌细胞的迁移。

TranswelI迁移实验指用聚碳酸酯膜将高营养培养基和低营养培养基隔开，再将肿瘤细胞放人低营养培养基中，为了得到营养，肿瘤细胞必须穿过膜进入高营养培养基中，而穿过膜进入高营养培养基的细胞数的多少就能反映肿瘤细胞的迁移能力。本研究通过Transwell迁移实验检测加入Ca-G后MDA-MB-231细胞的迁移能力的大小。实验结果显示，药物作用后MDA-MB-231细胞迁移能力显著减弱，说明Ca-G一定程度可以抑制乳腺癌细胞的迁移，本实验与创口愈合实验结果相一致。

由肿瘤细胞增殖和迁移引发的新血管形成称为血管生成，在肿瘤生长过程中这种血管不断为肿瘤提供新的营养物质，去除代谢物。如果没有新血管的形成，肿瘤生长会受到一定限制。因此，血管生成是肿瘤生长的其中一个关键步骤，抗血管生成己成为近年来研究肿瘤治疗的关键方法。血管生成可受到多种生长因子和细胞因子的调节。在这些因子中产生最多的是血管内皮生长因子（VEGF），VEGF一般被认为是参与肿瘤生长最有效的血管生成因子。VEGF的通过结合受体酪氨酸激酶来刺激肿瘤细胞增殖、迁移和管形成。VEGF受体（VEGFR）活化可导致下游信号通路的激活，如磷酸肌醇3-激酶（P13K）/蛋白激酶B（AKT），粘着斑激酶（FAK）。本文章研究了Ca-G的抗血管生成作用及潜在机制，结果表明，Ca-G通过抑制VEGF/AKT/FAK信号通路显著抑制乳腺癌细胞迁移。

总之，告达庭3-O-β-D-加拿大 麻糖苷可有效抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231的迁移和血管生成的活性。这为告达庭及其衍生物抗肿瘤转移和新生血管生成的进一步研究提供一定基础。