甜茶叶中总黄酮大孔树脂纯化工艺及抗氧化活性研究

王小明,2,陈 碧,2,张 鹏,2,赖冬群,钟翠娟

(1.广西科技师范学院食品与生化工程学院,广西来宾 546199; 2.广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室,广西来宾 546199)

甜茶(RubussuavissimusS.Lee)又名甜叶悬钩子,属蔷薇科,为悬沟子属多年生灌木,甜茶叶中含有的类黄酮、甜茶多酚[1]和甜茶素等活性成分,具有抗氧化[2]、抗过敏、抗菌、预防皮肤光损伤[3]、降“三高”等功效[4],在我国西南地区民间作为药食兼用食材使用已有几百年的悠久历史[5-10]。

黄酮类化合物是广泛分布在各种植物中的一种有效活性物质,是母核结构为2-苯基色原酮的多酚类化合物[11],多以糖苷形式存在于物质中[12],具有良好的清除自由基和中断链式反应的抗氧化性能[13]。大孔树脂是一类具有多孔骨架结构,表面积大、孔隙率高、交换速度快且不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高聚物吸附剂,具有选择性好、适用范围广等特点,广泛应用于类黄酮等天然活性物质的纯化和富集[14-16]。开展甜茶叶中总黄酮抗氧化性能的研究有助于开发其保健价值[17]。生物活体的多种疾病都与自由基对机体的氧化损伤密切相关,其作用机理被认为与清除自由基、调节细胞氧化还原系统、增强细胞内抗氧化酶系的活力等有关[18]。检测活性成分清除DPPH·能力和总抗氧化能力是评价其抗氧化活性的常用方法。因此,从天然成分甜茶叶中提取并纯化总黄酮,研究并评价其清除自由基的能力具有十分重要的意义[19-21]。

本文利用12种不同极性的大孔树脂对提取的甜茶叶粗黄酮进行纯化性能的对比研究,在静态吸附和解吸、静态吸附动力学实验的基础上,研究上样液、洗脱剂乙醇溶液浓度对较优大孔树脂动态吸附和解吸率的影响,优选出甜茶叶粗黄酮纯化工艺条件,制备出甜茶叶精黄酮,以芦丁和维生素C为对照,对甜茶叶粗黄酮、精黄酮的清除DPPH·能力和总抗氧化能力(T-AOC)进行对比分析,以期为甜茶叶总黄酮开发应用提供更多工艺技术和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干甜茶叶片 产自广西来宾金秀县(无茶梗,三个月内生产,水分含量2.12 g/100 g,用粉碎机粉碎后过50目筛备用);芦丁标准品(纯度>99%)、维生素C标准品(纯度>99%) 合肥博美生物科技有限责任公司;无水乙醇、硝酸铝(Al(NO3)3)、亚硝酸钠(NaNO2)、氢氧化钠(NaOH)等 均为国产分析纯;1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH·,纯度>97%) 东京化成工业株式会社;总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒 上海抚生实业有限公司;大孔吸附树脂NKA、HPD-500、NKA-9、S-8、HPD-450、DM130、AB-8、LS-300B、D101、HP-20、HPD-100、X-5 廊坊淼阳化工有限公司。

UV-1750紫外可见分光光度计 日本岛津公司;HH-2数显电子恒温水浴锅 江苏省金坛市友联仪器研究所;FS-1500超声波萃取仪 上海生析超声仪器有限公司;KQ3200DA型数控超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司;H1850台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;R-1001VN旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司;XW-80A型旋涡混合器 上海医大仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甜茶叶总黄酮超声波-乙醇提取方法 准确称取0.5 g的干甜茶叶粉末于圆底烧瓶或玻璃试管中,按照乙醇浓度为68.9%、料液比为1∶30 (g/mL)、超声波功率为73.9 W、提取温度为62.2 ℃、提取时间为67.7 min,此工艺条件下甜茶叶总黄酮提取得率为12.23%,得到甜茶叶总黄酮提取液[22]。

1.2.2 上样液及显色溶液的制备 将按“1.2.1”方法制得的甜茶叶总黄酮提取液用定性滤纸抽滤得滤液,经减压浓缩后得到干粗提物,用水溶解干粗提物,定性滤纸过滤,定容到50 mL容量瓶后制得吸附所需浓度为1.0137 mg/mL的上样液。准确量取待上样液2.5 mL,转入10 mL容量瓶中,加5% NaNO2溶液0.3 mL,摇匀,放置10 min,再加10% Al(NO3)3溶液0.5 mL,摇匀,放置10 min,最后再加4% NaOH溶液5.0 mL,振摇,加纯水至刻度,摇匀后放置10 min,即得显色溶液。

1.2.3 总黄酮含量的测定

1.2.3.1 标准曲线的制作 准确称取芦丁标准品2.5000 mg,转入25 mL容量瓶中,以纯水溶解并定容,配制得0.1000 mg/mL芦丁标准溶液。准确移取芦丁标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中,分别加入5% NaNO2溶液0.3 mL,摇匀,静置10 min;再加10% Al(NO3)3溶液0.5 mL,摇匀,静置10 min;再加4% NaOH溶液5 mL,以纯水定容,摇匀,静置10 min,从200～700 nm进行全波长扫描,均测得在510 nm处有最大吸光度,因此选定以510 nm为芦丁和样品溶液总黄酮浓度的测定波长[23-27]。在510 nm波长下测各容量瓶中溶液的吸光度,以芦丁浓度(Y，mg/mL)和吸光度(X)进行线性回归,得标准曲线方程:Y=0.0819X+0.0001(R2=0.9998)。

1.2.3.2 待测样液中总黄酮浓度的测定 按1.2.1方法得到2.5 mL待测样液总黄酮浓度Y1(mg/mL),依公式(1)计算待测样液中总黄酮浓度Y0(mg/mL)。

式(1)

其中:Y0为吸附前后待测样液的浓度(mg/mL);Y1为从待测样液中吸取2.5 mL进行显色的显色溶液总黄酮浓度(mg/mL);10为定容到10 mL容量瓶中。

1.2.4 甜茶叶总黄酮的纯化

1.2.4.1 大孔树脂预处理 将大孔树脂先用无水乙醇浸泡24 h,使其充分溶胀,再用纯水冲洗至洗涤水无浑浊、无悬浮杂质、无醇味。纯水水洗之后分别用4%的HCl溶液和NaOH溶液各浸泡3 h,最后用纯水洗至中性,备用[14]。

1.2.4.2 大孔树脂的静态吸附和解吸 准确称取预处理后的12种型号大孔树脂(NKA、HPD-500、NKA-9、S-8、HPD-450、DM130、AB-8、LS-300B、D101、HP-20、HPD-100、X-5)各2.00 g(湿质量)装入100 mL具塞锥形瓶中,分别精密加入50 mL(记为V)，按“1.2.2”方法制得的上样液(1.0137 mg/mL),按“1.2.3.2”的方法计算其吸附前后待测样液总黄酮浓度记为Y0,将上样液在恒温水浴振荡器中振摇吸附24 h,取上清液用定性滤纸过滤,按“1.2.3.2”的方法计算吸附后溶液中总黄酮浓度(记为Y2)。将滤出的各树脂另装入100 mL具塞锥形瓶中,分别精密加入60%乙醇50 mL(记为V1),在恒温水浴振荡器中振摇解吸24 h,得解吸后溶液,取上清液过滤,按“1.2.3.2”的方法计算解吸后溶液中总黄酮浓度(记为Y3)。根据公式(2)计算静态吸附量(mg/g)、根据公式(3)计算静态吸附率(%)、根据公式(4)计算静态解吸量(mg/g)、根据公式(5)计算静态解吸率(%)。

式(2)

式(3)

式(4)

式(5)

其中:Y0为吸附前上样液中总黄酮浓度(mg/mL)；Y2为吸附后样液中总黄酮浓度(mg/mL)；Y3为解吸后样液中总黄酮浓度(mg/mL)；V为吸附上样液体积(mL)；V1为解吸液体积(mL)；m为湿树脂质量(g)。

1.2.4.3 大孔树脂的静态吸附动力学实验 称取预处理好的HPD-450、AB-8、HPD-500、NKA-9、D101大孔树脂各2.0 g,装入100 mL具塞锥形瓶中,精确加入质量浓度为1.0137 mg/mL的上样液50 mL,在恒温振荡器中振荡,每隔1 h取上清液测定吸光度并计算吸附率,绘制这5种大孔树脂静态吸附动力学曲线[28-29]。

1.2.4.4 上样液对HPD-450大孔树脂动态吸附的影响 取处理好的大孔树脂30 g,采用湿法装柱的方式装入层析柱中,分别取5份质量浓度为0.3125、0.6171、0.9167、1.2875、1.5424 mg/mL的甜茶叶总黄酮样液200 mL,以1.5 BV/h流速上柱,每10 mL收集一次流出液,分别测定流出液总黄酮含量,以流出液甜茶叶总黄酮的浓度对流出液体积作图,绘制不同浓度甜茶叶总黄酮的穿透曲线;合并流出液测定总黄酮的含量并计算吸附的总黄酮质量及吸附率[28-29]。

1.2.4.5 洗脱剂乙醇溶液浓度对HPD-450大孔树脂解吸效果的影响 分别取6份浓度为0.9167 mg/mL的甜茶叶黄酮样液150 mL,以1.5 BV/h流速上柱,将吸附饱和的树脂用纯水冲洗至流出液无色,分别用10%、25%、40%、55%、70%和85%乙醇溶液洗脱,流速为1.5 BV/h,每10 mL收集1管洗脱液,每次收集的洗脱液与之前所有收集的洗脱液合并,测定合并后洗脱液中总黄酮的含量,计算解吸率,绘制不同浓度乙醇溶液的动态解吸曲线,筛选较优洗脱剂浓度和洗脱剂用量[28-29]。

1.2.4.6 甜茶叶精黄酮的制备与精黄酮纯度测定 按照较优工艺的优选方法:选用最佳大孔树脂,较好上样液质量浓度,最佳上样量,上样液以1.5 BV/h流速上柱,依次用2 BV纯水洗脱,以最佳乙醇质量浓度55%和乙醇用量170 mL洗脱,将流出的溶液旋干,准确称取一定质量(m1)的旋干后的固体粉末溶于一定量(V2)的纯水中,按“1.2.3.2”的方法计算其总黄酮浓度记为Y3,按公式(6)计算经大孔树脂纯化后甜茶叶精黄酮纯度(%),按公式(7)计算经大孔树脂纯化后甜茶叶总黄酮回收率(%)。

式(6)

式(7)

1.2.5 抗氧化活性试验 甜茶叶黄酮样液浓缩干燥所得样品为甜茶叶粗黄酮,经大孔树脂纯化后所得样品为甜茶叶精黄酮,以维生素C、芦丁为对照,分别测定维生素C、芦丁、甜茶叶粗黄酮和甜茶叶精黄酮四种样品对DPPH·自由基的清除能力和各自的总抗氧化能力(T-AOC),从而评价甜茶叶粗黄酮和甜茶叶精黄酮的抗氧化活性[30-32]。

1.2.5.1 清除DPPH·能力 参照滕昭玉等[33]的方法,准确移取0.2 mg/mL DPPH·无水乙醇溶液1.6 mL和1 mL不同的待测试样(甜茶叶粗黄酮、甜茶叶精黄酮、维生素C、芦丁)于10 mL具塞比色管中,用无水乙醇定容并摇匀,避光放置30 min,用无水乙醇做参比液在517 nm处测定吸光度,记为Ai;按上述步骤和方法不加待测试样测吸光度,记为A0;按上述步骤和方法不加DPPH·无水乙醇溶液测吸光度,记为Aj。DPPH·清除率用公式(8)计算。

式(8)

1.2.5.2 总抗氧化能力(T-AOC) 参照(T-AOC)试剂盒说明进行总抗氧化能力测定。

1.3 数据处理

每组实验作3次平行或重复实验,结果取平均数,实验数据采用Microsoft Excel 2010软件和Origin 8绘图软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 12种大孔树脂的静态吸附和解吸效果

表1 12种大孔树脂的静态吸附和解吸效果Table 1 Static adsorption and desorption effects of 12 macroporous resins

由表1可知,从12种大孔树脂24 h的静态吸附和解吸效果来看,对甜茶叶总黄酮吸附率超过75%的大孔树脂类型由高到低依次是HPD-500、HPD-450、NKA-9、AB-8、D101,解吸量排在前5位的大孔树脂类型由高到低依次是HPD-450、HPD-500、NKA-9、AB-8、D101,解吸率排在前5位的大孔树脂类型由高到低依次是HPD-450、NKA-9、AB-8、LS-300B、HP-20,弱极性和极性大孔树脂比非极性大孔树脂更适合于甜茶叶总黄酮的分离纯化,这与王国军等[14]大孔树脂纯化核桃隔膜总黄酮的研究结果相似,造成这种现象的原因可能是弱极性大孔树脂既可在极性溶剂中吸附非极性物质,又可在非极性溶剂中吸附极性物质。经综合评价分析(主要比较吸附量和解吸量,选择既吸附性能好又解吸性能好的树脂类型),选取表现较好的5种大孔树脂HPD-450、HPD-500、NKA-9、AB-8、D101作静态吸附动力学实验。

2.2 大孔树脂的静态吸附动力学曲线

由图1可知,HPD-450大孔树脂对供试液的吸附率在前4 h升高较快,静态吸附4 h时其吸附率达到68.45%,已经接近吸附10 h时的最大吸附率75.89%;其他4种树脂对供试液的吸附率均在前7 h升高较快,7 h后其吸附率才趋于稳定达到最大值。5种大孔树脂7 h的静态吸附率由高到低依次是HPD-450、D101、HPD-500、AB-8、NKA-9,结合这5种大孔树脂的吸附速率综合分析,选择HPD-450大孔树脂为甜茶叶总黄酮分离纯化的最佳大孔树脂。这与王国军等[14]研究的8 h静态吸附率AB-8>HPD-450≈HPD-500大孔树脂的结果略有不同。

图1 5种大孔树脂静态吸附动力学曲线Fig.1 Static adsorption kinetics curves of five macroporous resins

2.3 上样液对HPD-450大孔树脂动态吸附效果

由图2可知,在相同流速1.5 BV/h条件下,用不同浓度的甜茶叶总黄酮样液过柱,流出液中总黄酮浓度的总体表现趋势为:当流出液体积相同时,上样液的浓度越大,流出液中总黄酮浓度增加就越明显,即随着上样液浓度的增加,流出液中总黄酮的含量增加,样液中总黄酮的损失率增高。当上样量较小时,树脂对总黄酮的吸附随着上样量增加而不断增大,原因是起始阶段树脂表面有足够的基团吸附总黄酮,随着树脂表面基团逐渐饱和其吸附能力不断减弱,表现为流出液浓度升高,当流出液中甜茶叶总黄酮的质量浓度达到上样液的10%时,即认定为大孔树脂已饱和并发生穿透[14]。如图2，当用0.3125、0.6171、0.9167、1.2875、1.5424 mg/mL的甜茶叶总黄酮样液过柱时,达到饱和穿透所对应的上样量体积分别为120、160、140、100、80 mL。此条件下大孔树脂吸附的甜茶叶总黄酮质量分别为34.79、92.34、120.22、121.37、115.41 mg,所对应的吸附率分别为92.77%、93.52%、93.67%、94.27%、93.53%。从大孔树脂发生穿透时的吸附量和吸附率分析,当上样液浓度为1.2875 mg/mL、上样量100 mL时,大孔树脂的吸附量最大、吸附率也最高。因此确定较好的上样条件为:上样液浓度1.2875 mg/mL、上样量体积100 mL。

图2 不同浓度甜茶叶总黄酮的穿透曲线Fig.2 Penetration curve of total flavonoids of sweet tea with different concentrations

表2 甜茶叶粗黄酮、甜茶叶精黄酮、维生素C以及芦丁清除DPPH·的线性方程Table 2 Linear equation for DPPH· scavenging of sweet tea crude flavonoids,sweet tea refined flavonoids,vitamin C and rutin

2.4 洗脱剂乙醇对HPD-450大孔树脂解吸效果

由图3可知,洗脱液合并后的解吸率总体表现趋势为随着洗脱剂乙醇浓度的增大而增高,当乙醇浓度达到55%以上时,随着乙醇浓度的增高其解吸率增高不明显,因此选择洗脱剂乙醇浓度为55%。当洗脱剂乙醇浓度为55%,洗脱剂用量达到170 mL时,洗脱液合并后的解吸率达到或接近最大值,之后随洗脱剂用量的增加,解吸率变化不大。因此选择洗脱剂乙醇用量为170 mL。

图3 不同浓度乙醇溶液的动态解吸曲线Fig.3 Dynamic desorption curve of ethanol solution with different concentrations

2.5 甜茶叶总黄酮的纯化与最佳工艺验证

按照上述优选的较优工艺条件:选用HPD-450大孔树脂,上样液质量浓度为1.2875 mg/mL,上样量100 mL(上样量体积与树脂质量比为10∶3),上样液以1.5 BV/h流速上柱,依次用2 BV纯水洗脱,170 mL 55%乙醇洗脱,将流出的溶液旋干,称质量。做3次平行试验。纯化前粗黄酮样品质量128.75 mg,纯化前总黄酮含量20.96 mg,粗黄酮纯度为16.28%;经纯化工艺处理后,经测定计算得精黄酮纯度和回收率,结果显示,3次平行试验纯化后精黄酮纯度分别为30.43%、32.11%、32.82%,精黄酮纯度平均值为31.79%;3次平行试验回收率分别为89.07%、90.89%、91.51%,该工艺下的平均回收率为90.49%。结果显示在上述工艺条件下,HPD-450大孔树脂对甜茶叶总黄酮的吸附纯化率和回收率较高,且稳定。

2.6 甜茶叶总黄酮的抗氧化活性效果

2.6.1 甜茶叶总黄酮对DPPH·的清除效果 由图4可知,在一定浓度范围内甜茶叶总黄酮对DPPH·清除能力随浓度的增加而提高,这与胡芳等[34]金丝小枣类黄酮随着时间和浓度的增加抗氧化能力逐渐增强的研究结果相似。甜茶叶粗黄酮、甜茶叶精黄酮、维生素C以及芦丁对DPPH·清除能力强弱顺序为维生素C>甜茶叶粗黄酮>甜茶叶精黄酮>芦丁,这与张彩云[35]研究的在浓度低于0.08 mg/mL时强弱顺序为甜茶叶粗黄酮>甜茶叶精黄酮>维生素C的结果不同;甜茶叶粗黄酮对DPPH·清除能力强于甜茶叶精黄酮可能与甜茶叶粗黄酮粗品体系中各种抗氧化活性物质之间相互协同作用有关[36]。由表2可知,甜茶叶粗黄酮、甜茶叶精黄酮、维生素C、芦丁的IC50值分别为0.0187、0.0202、0.0175和0.0265 mg/mL,表明甜茶叶粗黄酮比甜茶叶精黄酮具有较强的抗氧化活性,且两者对DPPH·的清除效果均低于维生素C、高于芦丁。

图4 不同样品对DPPH·的清除效果Fig.4 Scavenging effect of DPPH· on different samples

图5 不同浓度样品的总抗氧化能力效果Fig.5 Effects of total antioxidant capacity of samples with different concentrations注:不同小写字母表示同浓度下不同样品 总抗氧化能力差异显著,P<0.05。

2.6.2 甜茶叶总黄酮总抗氧化能力(T-AOC)效果 由图5可知,甜茶叶粗黄酮、甜茶叶精黄酮、维生素C以及芦丁各自的总抗氧化能力随浓度的增大而增强。在各浓度梯度的总抗氧化能力由强到弱的顺序均表现为甜茶叶粗黄酮>甜茶叶精黄酮>维生素C>芦丁。这与它们对DPPH·清除效果表现有所不同。在0.02 mg/mL浓度组内,甜茶叶粗黄酮总抗氧化能力显著大于甜茶叶精黄酮、维生素C、芦丁,甜茶叶精黄酮总抗氧化能力大于维生素C但两者差异不显著;在0.03、0.04 mg/mL浓度组内,甜茶叶粗黄酮总抗氧化能力大于甜茶叶精黄酮但两者差异不显著,而两者均显著(P<0.05)大于维生素C;甜茶叶粗黄酮、维生素C、精黄酮在3个不同浓度组内的总抗氧化能力均显著大于芦丁。这与孙海燕[21]樱桃核中类黄酮的总抗氧化能力(5.03 U/mL)高于维生素C(3.32 U/mL)以及张文华[37]、张彩云[35]的研究结论相近。

3 结论

HPD-450对甜茶叶总黄酮分离纯化效果最佳。30 g HPD-450大孔树脂动态吸附上样条件为:上样液浓度1.2875 mg/mL、上样量体积100 mL;洗脱液合并后对HPD-450大孔树脂的解吸率总体表现趋势为:随着洗脱剂乙醇浓度的增大而增高,乙醇浓度达到55%以上时其解吸率增高不明显,因此确定洗脱剂乙醇浓度为55%;洗脱剂用量达到170 mL时,洗脱液合并后的解吸率达到或接近最大值,因此确定洗脱剂乙醇用量为170 mL。按照确定的较优纯化工艺条件进行验证,纯化后精黄酮纯度为31.79%,试验回收率为90.49%,在该纯化工艺条件下,HPD-450大孔树脂对甜茶叶总黄酮的吸附纯化率和回收率较高且稳定。

甜茶叶粗黄酮、甜茶叶精黄酮、维生素C、芦丁对DPPH·的IC50值分别为0.0187、0.0202、0.0175和0.0265 mg/mL,表明甜茶叶粗黄酮比甜茶叶精黄酮具有较强的清除DPPH·能力,甜茶叶粗黄酮、精黄酮对DPPH·清除能力均低于维生素C而高于芦丁。从总抗氧化能力(T-AOC)效果评判,在0.02 mg/mL浓度组内,甜茶叶粗黄酮总抗氧化能力显著大于甜茶叶精黄酮、维生素C、芦丁,甜茶叶精黄酮总抗氧化能力大于维生素C但两者差异不显著;在0.03、0.04 mg/mL浓度组内,甜茶叶粗黄酮总抗氧化能力大于甜茶叶精黄酮但两者差异不显著,而两者均显著大于维生素C。表明甜茶叶总黄酮具有较好的体外自由基清除效果和较高的总抗氧化能力。但甜茶叶中具有活性的黄酮类化合物种类有待进行分离和鉴定,同时,其体内抗肿瘤活性等试验研究可为甜茶叶的深入开发应用提供理论依据。