两种酿酒酵母发酵对桑葚米酒理化品质及香气成分的影响

(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

桑葚是桑科植物的聚花果[1],其营养丰富,富含白黎芦醇、花色素、原花青素、有机硒等生理活性成分[2-3]。作为一种药食两用水果,桑葚具有生津止渴、滋阴补血、利关节、祛风湿、解酒等功效[4],桑葚中的生物活性物质具有降低血糖、血脂、抗氧化[5-9]、抗肿瘤[10]等作用。米酒是我国传统的酒类饮品,因其营养丰富具有延缓衰老、提高免疫力等保健功效[11]深受广大消费者的喜爱。桑葚米酒是以桑葚汁和大米为原料酿造出的低度酒精饮料,酒体鲜艳、口感独特、滋味丰富、富含花色苷等生物活性物质。

图1 桑葚米酒制备工艺流程图Fig.1 Process flow chart of mulberry rice wine preparation

目前对桑葚的研究主要集中在桑葚中功能性成分的研究,如桑葚中原花青素的研究[12],桑葚中抗氧化活性物质的研究[13]和桑葚果酒、果醋加工工艺方面的研究[14-15],但对以桑葚和大米为原料酿造米酒的工艺研究较少。刘功良等[15]采用果酒活性干酵母发酵桑葚酒,但酒的总酸相对偏高。于军[16]利用清酒酵母(sake yeast)1296发酵青稞清酒,成品青稞酒质量优、口感好。吴赫川等[17]利用清酒酵母酿造籼米清酒并对清酒中风味物质进行了研究,结果发现籼米清酒中苯乙醇和辛酸乙酯的相对含量较高。于亚敏等[18]采用两种酿酒酵母以不同比例混合发酵赤霞珠干红葡萄酒,结果发现两种酿酒酵母混菌发酵可以提高葡萄酒的酒精度,增强酒的香味。

为提高桑葚米酒的品质,本实验采用清酒酵母和果酒活性干酵母为发酵菌种，混合发酵酿造低度桑葚米酒,并使用顶空-固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析酵母菌种和接种顺序对桑葚米酒中香气形成的影响,为开发出高品质的桑葚米酒提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑桑葚 芜湖市瓜果市场;东北大米 老农帝国产业基地;清酒酵母(sake yeast)CICC 30399 中国微生物菌种保藏中心;果酒活性干酵母sy 安琪酵母股份有限公司;α-淀粉酶(50000 U/g) 安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心;糖化酶(50000 U/g)、果胶酶(10000 U/g) 上海源叶生物有限公司;3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、偏重亚硫酸钾、邻苯二甲酸氢钾、盐酸 分析纯,国药集团。

HH-S4数显恒温水浴锅 常州普天仪器制造有限公司;岛津OP2010plus气质联用仪 日本岛津公司;手动顶空-固相微萃取进样器、100 μm PDMS萃取头 美国Supelco公司;L-550离心机 湖南湘仪仪器开发有限公司;L3可见分光光度计 上海仪电仪器分析有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 大米粉培养基,称取100 g大米磨粉,加水熬煮(料水比1∶5)40 min,冷却至60 ℃加入α-淀粉酶(酶加量100 U/g)和糖化酶(酶加量100 U/g)并保温反应6 h,反应结束后抽滤两次,滤液于115 ℃高压杀菌20 min;果酒活性干酵母活化培养液,称取5 g葡萄糖用无菌水定容至100 mL,115 ℃高压杀菌20 min。

1.2.2 桑葚米酒的发酵工艺 桑葚米酒的生产工艺如图1所示,操作要点如下:首先制备桑葚果汁,取-24 ℃下冷冻的桑葚在4 ℃解冻,将解冻后的桑葚放入榨汁机中压榨倒出并添加0.4%的果胶酶在45 ℃下水浴加热60 min。处理过的桑葚汁过滤后迅速加入偏重亚硫酸钾溶液,使桑葚汁中SO2浓度为60 mg/L[19];然后进一步发酵桑葚米酒,大米浸泡6 h后加水(料水比1∶5 g/mL)熬煮,熬制2 h,熬煮过程中不断搅拌,使大米淀粉充分糊化,成为醪液。糊化后将醪液冷却至60 ℃加入α-淀粉酶(酶加量100 U/g)和糖化酶(酶加量100 U/g)在60 ℃酶解6 h,酶解结束后将醪液煮沸5 min,冷却至室温后加入处理过的桑葚汁,1 L醪液加250 mL桑葚汁。加糖调节使得发酵液糖浓度到22 brix%,加碳酸钙调节pH为4.5后接入酵母发酵一定时间。发酵结束后将酒液置于4 ℃冷藏处理,使酒液中的单宁和果胶等物质沉降,澄清结束后灌装。

1.2.3 酵母菌的活化 活性干酵母的活化:取20 mL灭菌的活化培养液,加入果酒活性干酵母于35 ℃隔水式恒温培养箱活化30 min。清酒酵母的活化:将清酒酵母菌种从斜面培养基上接种到大米粉培养液中,在30 ℃条件下培养24 h。

1.2.4 发酵方式 为研究酵母菌的发酵方式对桑葚米酒风味形成的影响,采用5种发酵方式,分别为:发酵方式Ⅰ(接种3‰清酒酵母);发酵方式Ⅱ(接种3‰果酒活性干酵母);发酵方式Ⅲ(接种1.5‰清酒酵母发酵7 d后再接种1.5‰活性干酵母);发酵方式Ⅳ(接种1.5‰活性干酵母发酵7 d后再接种1.5 ‰清酒酵母);发酵方式Ⅴ(同时接种1.5‰清酒酵母和1.5‰果酒活性干酵母)。5种发酵方式发酵温度均为22 ℃,发酵时间为20 d。

1.2.5 桑葚米酒理化指标的测定方法 酒精度的测定方法:在20 ℃左右时用容量瓶量取不同发酵阶段的桑葚米酒100 mL,移入500 mL蒸馏瓶中,用100 mL蒸馏水分次洗涤容量瓶后并入蒸馏瓶中,向蒸馏瓶中加入几颗玻璃珠加热蒸馏。蒸馏过程中用原100 mL容量瓶收集蒸馏液(冰浴),至馏出液体积为95 mL左右时停止蒸馏,并用蒸馏水定容至100 mL。将馏出液倒入100 mL量筒中,测量和记录馏出液的温度和酒精度,最后换算成20 ℃时的酒精度。桑葚米酒中总酸、挥发酸和还原糖含量分别采用指示剂滴定法和直接滴定法测量[20]。

表1 桑葚米酒感官评分标准Table 1 Sensory scoring criteria for mulberry rice wine

1.2.6 感官评分方法 感官评分方法参照NY/T 1885-2017《绿色食品 米酒》[21]对桑葚米酒进行感官评分,感官评分小组由8人组成,分别从色泽、澄清度、滋味、香气、典型性5项对桑葚米酒进行打分,5项评分总得分即为桑葚米酒的感官评分,具体评分标准见表1。

1.2.7 桑葚米酒香气成分分析 采用顶空-固相微萃取(HS-SPME)法处理样品,取发酵结束后的桑葚米酒8 mL加入到25 mL萃取瓶中,加入1.0 g NaCl,以聚四氟乙烯隔垫密封。萃取针头经老化处理后插入萃取瓶中推出萃取针头,将样品置于45 ℃水浴中萃取45 min后将萃取头插入GC-MS分析仪器进样口,解析5 min[22]。解析完成后启动仪器采集样品数据。色谱条件:色谱柱为DB-5MS(30×0.25 mm,0.25 μm);进样口温度250 ℃;升温程序:35 ℃保持4 min,以10 ℃/min升至110 ℃,保持3 min,再以5 ℃/min升至150 ℃,保持2 min,最后以7 ℃升至230 ℃,保持6 min;载气(He)流速1.00 mL/min,压力53.5 kPa,进样量1 μL;不分流[22]。质谱条件:电离方式:电子电离(electron ionization,EI)源;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;采集模式:全扫描;四极杆温度150 ℃;质量扫描范围m/z 30～500;扫描速率769 u/s;质谱图利用NIST 08谱库进行检索。

GC-MS检测数据由岛津GC-MSD数据工作站进行处理,检测出的化合物与NIST08谱图库进行对比,对相似度大于80%的物质进行质谱图的比对和分析,同时参考相关文献[23-24]确定桑葚米酒中风味物质的成分,利用峰面积归一法确定桑葚米酒中风味物质的相对含量

1.2.8 气味活度值(ROAV)的计算方法 参考刘登勇等[25]的方法,利用相对气味活度值(ROAV)来描述米酒中香气物质对米酒主体风味的贡献,ROAV的计算公式如下:

式中,ROAVA代表各香气组分相对气味活度值,CA和TA分别为各香气组分的相对含量(%)和香气阈值(μg/kg),Cstan和Tstan分别为对样品风味贡献最大的香气成分的相对含量(%)和香气阈值(μg/kg)。

1.3 数据处理

文中所有数据采用Excel 2007软件、Origin 8.5软件进行处理和分析。其中主成分分析采用SPSS 18.0软件分析。

2 结果与分析

2.1 发酵方式对桑葚米酒发酵的影响

由图2可知,5种发酵方式发酵桑葚米酒在发酵第一阶段(3～7 d)酒精度上升较快,此时发酵液中糖含量高,酵母繁殖速度加快,酒液中乙醇含量快速上升,但由于发酵方式Ⅲ和Ⅳ中酵母接种量较少,其酒精发酵速度慢于发酵方式Ⅰ和Ⅱ。发酵第二阶段(7～15 d),各发酵组酒精度上升变缓,但发酵方式Ⅲ和Ⅳ中新接种了酵母,其酒精发酵速度快于只添加清酒酵母发酵酒液(发酵方式Ⅰ)。

表2 不同发酵方式发酵桑葚米酒理化指标和感官评分Table 2 Physicochemical indices and sensory scores of mulberry rice wine fermented by different inoculation methods

发酵第三阶段(15～20 d),此时各组酒液的酒精度不在上升，发酵基本结束。由此可知5种发酵方式发酵米酒的主发酵阶段为15 d左右,发酵至20 d基本达到发酵终点。

图2 不同发酵方式发酵桑葚米酒酒精度的变化Fig.2 Alcohol degree of mulberry rice wine fermented by different fermentation methods

发酵20 d后桑葚米酒理化指标及感官评分如表2所示,由表2和图2可知,发酵方式Ⅰ发酵的桑葚米酒残糖含量达到37.60 g/L,高于发酵方式Ⅱ组(26.50 g/L),这表明果酒活性干酵母对糖的利用率更高,发酵更彻底;发酵方式Ⅱ发酵桑葚米酒的酒精度(11.40%vol)和总酸含量(7.55 g/L)均高于采用清酒酵母发酵的桑葚米酒(Ⅰ组,9.30%vol,6.39 g/L),说明果酒活性干酵母产酒精能力和产酸能力强于清酒酵母,但产酸过多会导致米酒口感变差,影响酒体的协调性,其感官评分也明显低于清酒酵母发酵的桑葚米酒,两组酒液的挥发酸含量(Ⅰ组,0.36 g/L;Ⅱ组,0.34 g/L)基本相同。发酵方式Ⅲ和Ⅳ发酵桑葚米酒的酒精度、残糖含量和总酸含量非常接近,分别在10%vol、30 g/L和6.9 g/L左右,挥发酸含量Ⅲ(0.31 g/L)略低于Ⅳ(0.35 g/L)。采用混菌发酵的米酒感官评分均高于采用单一菌种发酵米酒的感官评分,表明采用混菌发酵有利于提升桑葚米酒的口感,其中发酵方式Ⅲ(接种清酒酵母发酵7 d后再接种果酒活性干酵母继续发酵)发酵桑葚米酒的口感最好。发酵方式Ⅴ发酵桑葚米酒中残糖含量(45.30 g/L)偏高,酒精度(8.70%vol)偏低,这可能是同时添加两种酵母发酵时,由于酵母间存在营养竞争导致酵母的繁殖速度缓慢,不利于米酒的发酵,导致米酒的酒精度偏低残糖过高,同时米酒的总酸(7.08 g/L)和挥发酸(0.42 g/L)含量偏高,感官评分(69.60)偏低,桑葚米酒的口感和风味较差。

表3 不同发酵方式发酵桑葚米酒中主要香气物质的相对含量(%)Table 3 Relative contents of main aroma substances in mulberry rice wine fermented by different inoculation methods

续表

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注:-,未查阅到相关阈值信息;-,未检测到香气成分;/未查到相关文献;表3同。

2.2 发酵方式对桑葚米酒香气成分的影响

桑葚米酒中香气成分一部分源于原料自身的香气物质,另一部分则是在发酵和后酵过程中微生物分解代谢蛋白质和糖类物质产生的代谢产物[27]。由表3可知,5种发酵方式发酵桑葚米酒中共检测出175种香气成分,其中酯类62种、醇类30种、酸类8种、醛类11种、酮类19种、烃类29种、其它物质16种。发酵方式Ⅰ-Ⅴ发酵桑葚米酒中分别检测出66、81、72、69、80种香气成分,两种酵母发酵的桑葚米酒中香气物质种类反而少于单独接种果酒活性干酵母发酵桑葚米酒,这是因为在酒类的发酵过程中不同酵母菌之间会相互利用异己菌株产生的代谢产物[28],导致两种酵母顺序接种发酵桑葚米酒中香气物质种类少于果酒活性干酵母单独发酵桑葚米酒。

酯类物质是酵母菌及乳酸菌等在发酵过程中产生的代谢产物,同时在酒的陈酿过程中也会生成酯类物质,大多数酯类物质具有水果香气和花香气味,酯类物质可以增加酒体的香味,有助于酒体形成浓郁厚重的风味。5种发酵方式发酵桑葚米酒中共检测出62种酯类物质,酯类物质对酒的香气形成有重要影响,是酒体主要呈香物质[29],酯类物质的含量会影响桑葚米酒的风味。发酵方式Ⅰ-Ⅴ发酵桑葚米酒中酯类物质相对含量分别74.25%、75.87%、65.12%、73.28%、69.68%,发酵方式Ⅱ发酵米酒中酯类物质相对含量较发酵方式Ⅰ发酵米酒高出1.62%,说明果酒活性干酵母发酵过程中产酯能力更强,两种酵母混合发酵会降低米酒中酯类物质的相对含量。5种酒样中主要的酯类物质是异戊酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、棕榈酸乙酯、乙酸乙酯。异戊酸乙酯具有水果香味,清酒酵母发酵桑葚米酒中异戊酸乙酯相对含量最高,为28.99%。辛酸乙酯具有菠萝和白兰地酒的香味,己酸乙酯有酒曲香和菠萝香味,果酒活性干酵母发酵米酒中辛酸乙酯和己酸乙酯相对含量都最高分别达到21.53%和7.24%。癸酸乙酯有梨香和白兰地酒的香味,5种酒样中癸酸乙酯的相对含量在8.02%～8.81%之间。棕榈酸乙酯有蜡香和奶油的香气,乙酸乙酯微带果香和酒香是曲酒和白酒的主体香气成分[30],发酵方式Ⅲ(接种清酒酵母发酵7 d后再接种果酒活性干酵母)发酵桑葚米酒中棕榈酸乙酯相对含量最高,较其它4组酒样高出3.17%～4.56%,乙酸乙酯相对含量较其他4组酒样高出2.04%～2.35%。

米酒在发酵过程中由于酵母的代谢作用会产生乙醇及β-苯乙醇、金合欢醇等具有香气的高级醇。5种发酵方式发酵米酒中共检测出30种醇类物质,共有的醇类物质有4种,分别是2,6-二甲基-4-庚醇、正辛醇、β-苯乙醇和香茅醇。

表4 不同发酵方式发酵桑葚米酒香气成分的ROAVTable 4 ROAV of aroma components in mulberry rice wine fermented by different inoculation methods

发酵方式Ⅲ(接种清酒酵母发酵7 d后再接种果酒活性干酵母)发酵桑葚米酒中醇类物质相对含量达到了19.15%,较其它4组酒样高出10.94%～13.37%。米酒在发酵过程中酵母通过艾氏(Ehrlich)途径将L-苯丙氨酸转化为β-苯乙醇,β-苯乙醇作为一种芳香醇类具有玫瑰花和蜂蜜的香气[31],赋予米酒醇香和优雅的香气特点是形成米酒风味的重要香气物质[32]。发酵方式Ⅲ发酵米酒中β-苯乙醇相对含量达到17.88%,相较于其它四组酒样高出2.63～3.96倍,这说明酵母的接种顺序会影响米酒中β-苯乙醇的相对含量,接种清酒酵母发酵7 d后再接入果酒活性干酵母的发酵方式会促进桑葚米酒中β-苯乙醇的形成。

桑葚米酒中酸类物质的种类和相对含量较少但香气阈值很高,这导致桑葚米酒中酸类物质的呈香性较小。5组酒样共检测出8种酸类物质,共有的酸类物质有4种。发酵方式Ⅰ发酵桑葚米酒中酸类物质相对含量最高为4.73%,发酵方式Ⅲ发酵桑葚米酒中酸类物质的含量最低为3.86%,接种清酒酵母发酵7 d后再接种果酒活性干酵母的发酵方式会降低米酒中酸类物质的含量。5种酒样中辛酸和癸酸的相对含量较高是桑葚米酒中酸类物质的主要成分。由于酸类物质在米酒中呈香性较弱,所以其对米酒风味的影响不大。

桑葚米酒中醛酮类物质的种类较多但其相对含量却很少,5种酒样中共检测出30种醛酮类物质,但其相对含量都不足1%。醛酮类物质对香气有一定的贡献,如3-甲基丁醛具有苹果香味,发酵方式Ⅲ发酵桑葚米酒中特有的苯乙醛具有类似风信子的香气。桑葚米酒中还含有烷烯烃、醚类和萜类等物质但其相对含量很少和呈香性较弱,对桑葚米酒特征风味形成的贡献较小。

2.3 不同发酵方式发酵桑葚米酒主体风味物质的确定

采用ROAV分析桑葚米酒中主要香气物质对米酒总体风味的贡献程度。己酸乙酯是白酒的特征香气成分,也是日本清酒的主要香气成分[33],根据表2中桑葚米酒部分风味物质的香气阈值和相对含量,己酸乙酯在5种发酵方式发酵桑葚米酒中的相对含量都超过1%,且香气阈值为1 μg/kg,对5种发酵方式发酵桑葚米酒风味的贡献最大,是桑葚米酒的主要风味成分,因此定义桑葚米酒中己酸乙酯ROAVstan=100[25-26],并计算桑葚米酒中其它风味物质的ROAV。当ROAV不小于1时,确定该挥发性物质为桑葚米酒的主体香气成分,0.1≤ROAV<1时确定该物质对桑葚米酒风味有重要贡献[26],5种发酵方式发酵桑葚米酒中ROAV≥0.1的物质共有14种,见表4。

由表4可知,主体风味成分为己酸乙酯、异戊酸乙酯、癸酸乙酯、壬醛、3-甲基丁醛、辛酸乙酯、癸醛、β-苯乙醇。发酵方式Ⅲ发酵桑葚米酒中香气物质明显多于其他4种发酵方式发酵桑葚米酒,其发酵桑葚米酒中有7种物质的ROAV≥1为米酒的主体风味成分,另有7种物质0.1≤ROAV<1对其酒体风味有重要贡献,主要呈香物质种类较多一定程度上反映了发酵方式Ⅲ发酵桑葚米酒的风味更加复杂和多样。

2.4 不同发酵方式发酵桑葚米酒香气成分的主成分分析

为了更直观的分析5种不同接种发酵方式发酵桑葚米酒中香气成分的差异,选取5种发酵方式发酵桑葚米酒中对风味成分有较大贡献的香气物质14种,对香气成分进行主成分分析。由图3a可知,5种发酵方式发酵桑葚米酒的香气成分的得分分布较分散,说明5种发酵方式发酵桑葚米酒的整体风味有较大差异。结合图3b得出,发酵方式Ⅰ和Ⅳ发酵桑葚米酒得分区域与呈果香味的己酸乙酯、异戊酸乙酯、癸酸乙酯得分区域大致相同,表明发酵方式Ⅰ和Ⅳ对桑葚米酒果香风味的形成有重要影响。发酵方式Ⅱ和Ⅴ发酵桑葚米酒得分区域和主要呈柑橘香和花香的壬醛、癸醛、橙花叔醇、庚酸乙酯得分区域大致相同,表明发酵方式Ⅱ和Ⅴ对桑葚米酒柑橘香和花香风味的形成有重要影响。发酵方式Ⅲ发酵桑葚米酒处在香气成分分布较密集区域与呈花香、果香、油脂香和奶油香气的3-甲基丁醛、辛酸乙酯、β-苯乙醇、棕榈酸乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醛、γ-庚内酯得分区域大致相同,这表明发酵方式Ⅲ发酵桑葚米酒的香气物质和呈香类型较多,成品米酒的香气更为复杂,果香花香和奶香味突出,香气也更浓郁。

图3 香气化合物主成分分析得分散点图和因子载荷图Fig.3 Score plot of aroma compound principal component analysis and factor load chart注:a:得分散点图;b:因子载荷图;A1～A14同表4。

3 结论

利用清酒酵母和果酒活性干酵母发酵桑葚米酒,考察酵母菌种类和发酵方式对桑葚米酒品质的影响。结果表明,果酒活性干酵母产总酸能力和产酒精能力强于清酒酵母,两种酵母顺序接种的发酵方式优于同时接种两种酵母的发酵方式。采用HS-SPME和GC-MS技术对5种酒样风味物质进行分析,结果发现,果酒活性干酵母发酵桑葚米酒中风味物质种类最多,酯类物质的相对含量最高为75.87%。接种清酒酵母发酵7 d后再接入果酒活性干酵母的发酵方式能提高酒体中醇类物质的相对含量,米酒中β-苯乙醇的相对含量较其他发酵方式高出2.63～3.96倍,β-苯乙醇赋予米酒醇香和优雅的香气,有助于桑葚米酒获得更高的感官评分。结合5种发酵方式发酵桑葚米酒中香气ROAV值对桑葚米酒中主要香气物质进行主成分分析,结果表明发酵方式Ⅲ即接种清酒酵母发酵7 d后再接入果酒活性干酵母发酵的桑葚米酒香气物质聚集较明显,米酒的风味更加复杂和浓郁。实验研究了酵母菌种类和发酵方式对桑葚米酒理化指标和香气成分的影响,为以后桑葚米酒混菌发酵工艺的开发和应用提供科学依据。