新型肝癌生物标志物的研究进展

梁靖晨，刘军杰

(广西医科大学附属肿瘤医院超声科，南宁530021)

我国肝癌的年病死率居肿瘤总病死率的第二位，其发病隐匿，进展较快，确诊时多已处于晚期，因此早期诊断对于改善患者的预后十分重要[1]。目前，早期的临床筛查方法主要是血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)检测和肝脏超声检查[2]。但AFP检测的灵敏度和特异度有限，而超声检查很大程度上依赖操作者的主观判断，且常规超声难以对肝脏占位性病变进行有效鉴别。因此，迫切需要寻找更有效、更准确的肝癌筛选方法。随着对肿瘤生物学认识的加深，液体活检在提高肝癌的早期发现、改善患者预后、提高生存率及生存质量等方面具有重要意义。为解决目前肝癌筛查和管理面临的挑战，有研究已经识别并评估了肝癌相关的分子标志物，越来越多具有高敏感性和特异性的肝癌生物标志物被发现并常规应用于临床检测，如甲胎蛋白异质体3(alpha-fetoprotein isoforms 3,AFP-L3)、热激蛋白90α(heat shock protein 90α，Hsp90α)及高尔基体蛋白73(golgi protein 73，GP73)等[3]。现就近年来肝癌生物标志物的研究进展予以综述。

1 基于蛋白组的肝癌生物标志物

1.1 与AFP功能互补的肝癌诊断标志物

1.1.1 AFP-L3及GP73 AFP-L3由恶性肿瘤细胞产生，是目前公认的预测肝癌的有效指标。美国食品药品管理局于2005年批准使用AFP-L3诊断肝癌，将诊断阈值界定为10%，即血清中的AFP-L3与AFP比率达到10%时，即使AFP的含量很低，也提示肝癌的高发生率,且不受影像学诊断阴性的影响[4]。研究表明，AFP-L3对肝癌的诊断具有极高的特异度(94%)，能够有效减少假阳性[5]。目前AFP-L3与AFP、脱-γ-羧基凝血酶原均被列入国家“十三五”传染病防治规划，将是未来国内外常用的肝癌诊断模式。

GP73属于Ⅱ型高尔基体跨膜蛋白，是用于诊断原发性肝癌的潜在新型标志物。Kladney等[6]指出GP73主要表达于胆管上皮细胞，在肝细胞内少见。李庆芝[7]分析研究了312例受试者血清中GPC3和AFP的表达差异，结果显示GP73诊断肝癌的灵敏度、特异度、阳性率分别为88.6%、92.1%和90.6%,而AFP分别为65.3%、71.2%、60.6%，且GPC3对AFP阴性患者也有很好的诊断价值，具有一定的单独诊断肝癌的能力。

目前临床上常将AFP-L3与GP73联合进行检测，有研究表明AFP-L3与GP73及AFP联合诊断肝癌的灵敏度、特异度分别为95.1%、91.6%，联合检测的灵敏度、准确度和阴性预测值均高于GP73、AFP和AFP-L3单项检测,但联合检测的特异度和阳性预测值与单项检测比较差异无统计学意义[8-9]。张平武和方林[10]研究发现GP73联合及AFP-L3对于低浓度AFP肝癌患者的检测具有更高的特异度、灵敏度及准确度，分别为96.3%、94.4%及98.2%。可见，AFP-L3联合GP73检测在诊断肝癌方面具有很高的可行性。

1.1.2 Hsp90α Hsp90α是一种分子伴侣蛋白，能与肿瘤组织中的癌基因相结合，促进肿瘤细胞的生长与转移。Sun等[11]使用差异蛋白质组学及酶联免疫吸附测定法分析证实Hsp90α在20例HCC患者血清中的含量增高，提示Hsp90α对肝癌的早期诊断和预后具有一定的意义。Fu等[12]对1 647名受试者的血清样本进行了检测，发现Hsp90α诊断肝癌的灵敏度为92.7%，特异度为91.3%；诊断AFP阴性肝癌患者的灵敏度为93.9%,特异度为91.3%；同时，对于早期肝癌及小肝癌(≤3 cm)也有一定的诊断能力。可见，Hsp90α是一种非常有效的肝癌生物标志物。目前Hsp90α检测试剂盒已获得国家食品药品监督管理总局批准初步应用于临床，对于早期监测肿瘤的发生、提高患者预后具有重要意义。

1.1.3 中期因子 中期因子是一种肝素结合细胞因子，具有抑制细胞正常凋亡、促进迁移等作用[13]。中期因子在大多数恶性肿瘤中均呈过表达。郭磊等[14]对501例包含肝癌在内的受试者的血清样本进行免疫组织化学分析，结果显示中期因子在癌组织中呈高表达；当中期因子的诊断阈值设定为0.752 ng/mL时，其特异度与AFP相似(81.1%比76.7%)，但灵敏度显著高于AFP(83.3%比51.2%),并且对AFP阴性的病例也有很好的诊断价值。刘晶华等[15]通过对50例肝癌患者的组织标本进行分析，发现沉默肝癌HepG2细胞内中期因子表达能够抑制肝癌细胞的生长和侵袭。由此可以推测中期因子是一种重要的癌蛋白，与肿瘤的增殖和转移密切相关。

1.2 与肝癌预后相关的蛋白类标志物

1.2.1 骨桥蛋白与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 骨桥蛋白是一种分泌型磷酸化蛋白质，在各种恶性肿瘤组织中均呈高表达。许多研究表明骨桥蛋白可能与肝癌的发生、发展、侵袭和转移密切相关[16-18]。郜玉峰等[16]发现骨桥蛋白联合细胞黏附因子CD44的变异体v6的检测可能有助于预测肝癌的早期复发和转移。张烜等[17]报道骨桥蛋白可以增强钙蛋白酶小亚基1启动子的转录活性，从而促进肝癌细胞的转移。许英艺等[18]通过Meta分析得出骨桥蛋白的表达与肿瘤包膜的完整性有关的结论，推测骨桥蛋白在肝癌的肝内浸润及肝外转移起重要作用。可见，骨桥蛋白在肝癌患者预后的判断上具有重要参考价值。然而目前其促进肝癌复发转移的机制尚未完全明确，并且针对肝癌骨桥蛋白靶向药物的开发研究较少，这应为未来的重点研究方向。

VEGF具有促进血管内皮细胞的增殖和分化并增强血管通透性的作用。Poon等[19]研究发现肝癌患者血清中的VEGF达到245 ng/L时，说明患者预后差、复发率高。有研究探讨联合检测VEGF与骨桥蛋白在预测肝癌患者术后复发转移以及生存中的临床价值，发现VEGF和骨桥蛋白单独检测时在相应的高表达组和低表达组2年复发率分别为83.3%、76.2%和38.9%、39.4%，而联合检测预期高风险和低风险患者2年生存率和复发率分别为36.4%、78.9%和81.8%、26.3%，表明骨桥蛋白和VEGF可作为预测肝癌术后复发转移的潜在参考分子指标[20]。

1.2.2 Dickkopf-1(DKK-1) DKK-1是一种分泌型糖蛋白，在Wnt-1信号转导通路中起拮抗作用，是目前最值得期待的肝癌诊断标志物之一。Kim等[21]研究表明肝癌患者的DKK-1水平明显高于对照组(中位数1.48 ng/mL比0.90 ng/mL，P<0.001),其诊断肝癌的灵敏度、特异度分别为90.7%和62.0%，将其与脱-γ-羧基凝血酶原和AFP联合检测时的AUC明显高于单个标记，且DKK-1过表达能够促进细胞迁移和侵袭，有助于评估患者预后。然而DKK-1作为肝癌生物标志物还有很多不足，如诊断特异性差、检测试剂盒价格昂贵等，因此仍需大量的研究探索DKK-1的价值及推进临床应用。

1.2.3 转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) TGF-β是一种具有多种生物学功能的超家族，通过调节免疫系统和肿瘤微环境促进癌细胞的扩散和转移。TGF-β1是TGF-β在哺乳动物体内的一种分型，在肝癌患者血清中的含量远高于正常成年人和其他肝病患者[22]。万裴琦等[23]研究了TGF-β1基因多态性与肝癌家族聚集的关系，发现携带TGF-β1-B位点C/C基因型和(或)TGF-β1-肝癌家族成员的C位G/A基因型基因具有更大的患肝癌风险。可见，TGF-β1对肝癌的预测有重要意义。此外，还有研究表明TGF-β1可以抑制肝癌肿瘤干细胞的增殖，研究开发有效的 与TGF-β1信号通路相关的抑制剂有望成为治疗肝癌的新策略[24]。

1.2.4 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3，GPC3) GPC3是一种硫酸乙酰肝素糖蛋白，在调控细胞生长、分化和迁移过程中起重要作用。研究显示，血清中高浓度GPC3对肝癌患者的检测灵敏度为75.0%，特异度为80.8%，作为肝癌诊断标志物具有潜在的价值。此外，GPC3对于肿瘤靶向免疫治疗也有一定意义[25]。人源化抗GPC3单克隆抗体作为单一药剂已通过Ⅰ期临床试验阶段，且无剂量限制性毒性。然而，Yen等[26]将185例肝癌晚期患者分为试验组和对照组，其中试验组接受1 600 mg/2周的人源化抗GPC3单克隆抗体静脉注射治疗，结果显示试验组的中位无进展生存期为2.6个月，对照组为1.5个月(P=0.87)，表明人源化抗GPC3单克隆抗体对肝癌并无显著疗效，其价值还需进一步研究。Gao等[27]将两种针对GPC3的抗体HN3和YP7融合到一段38 kDa的假单胞菌外毒素(PE38)中以产生免疫毒素，评估HN3-PE38和YP7-PE38的细胞毒性，并使用WST-1细胞增殖实验检测了在一组细胞系上抑制细胞增殖的作用，结果显示HN3-PE38和YP7-PE38对GPC3阳性细胞系均有高特异性的细胞毒性作用，而对GPC3阴性细胞系则无明显影响，且HN3-PE38比YP7-PE38更有效。可见，GPC3有望成为肝癌免疫治疗的新靶点，然而其分子特性及在肝癌中的作用机制尚未确定，仍有待进一步的拓展。

2 基于转录组的肝癌诊断生物标志物

2.1 AFP信使RNA(messenger RNA，mRNA) AFP mRNA从肝癌病变处分离入血并发生远处转移,通过检测血清AFP mRNA可以起到早期诊断肝癌、判断预后的作用。邱大鹏等[28]联合检测AFP mRNA和AFP-L3在肝癌患者中的表达情况，结果显示AFP mRNA和AFP-L3表达量明显高于肝硬化组和其他肝病组，对肝癌的鉴别诊断具有一定意义。同时AFP mRNA对于肝癌的复发转移也有监测作用。刘扬等[29]对62例原发性肝癌患者进行随访比对发现术前AFP mRNA阳性患者术后1、2、3年肿瘤复发率(58.3%、75.0%、100.0%)明显高于AFP mRNA阴性患者(23.6%、42.1%、68.4%)，且AFP mRNA阳性患者较易发生远处转移。因此，今后的研究应将如何消除术前血液中循环性肝癌细胞 (AFP mRNA阳性)作为重点，以达到阻断肿瘤复发转移的目的。

2.2 微RNA(microRNA，miRNA) miRNA是在动物、植物以及一些病毒中发现的约22个核苷酸的短链非编码RNA分子，参与基因的转录后调控。miRNA在肿瘤发生中起重要调节作用，一些miRNA在肝癌中上调起原癌基因的作用,如miR-17-5p、miR21、miR-210、miR-221、miR-222、miR-224；还有一些起抑癌基因的作用，如miR-122、miR-192、miR-199、miR-101、let-7家族、miR-99a，包括肝癌患者血清中降低的如miR-16、let-7f、miR-21、miR-139、miR-101、miR-122、miR-1[30-31]。在miRNA与肝癌侵袭转移方面的探究也取得了一些成果，如miR-221和miR-222能诱导肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抵抗从而增强肝癌细胞转移能力；miR-26a通过下调癌基因c-Myc、周期素依赖性激酶8和p21-活化激酶2来抑制异种移植肝癌的发展和原位肝癌的转移，是抑制c-Myc/组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶双高级肝细胞癌进展和转移的重要调控因子[32]。此外，还有研究表明miR-139-5p及其同型均有抑制肝癌的作用，且异构体的种类和数量越多，肿瘤的恶性程度越低[33]。Liang等[34]发现miR-106b在肝癌肿瘤组织中显著增加，并与靶向Zbtb7a基因有因果关系，miR-106b敲除能显著抑制Hub-7肝癌细胞的生长并增加细胞凋亡，提示miR-106b可作为肝癌的潜在治疗策略。综上可知，miRNAs对于肝癌的诊断和治疗具有重要价值，是近年来实验室的研究热点。然而miRNA的自身表达、相互作用以及与靶基因的相互调控网络目前仍不清晰，是未来需要研究的关键问题之一；如何通过已发现的miRNA抑癌作用进行肿瘤的靶向治愈也是需要攻克的重要难题。

2.3 环状RNA(circular RNA，circRNA) circRNA是一种新型的内源性非编码RNA，具有稳定的结构和较高的组织特异性表达[35]。研究表明，异常的circRNA表达在肝癌的发生与进展中起重要作用。Shang等[36]通过对circRNA表达谱的研究发现hsa_circ_0005075可参与肝癌发展过程中的细胞黏附，可作为肝癌的潜在标志物。林夏等[37]报道hsa_circ_0000711在肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中明显高表达，可能通过调控细胞周期及凋亡影响肝癌细胞的增殖。Fu等[38]采用circRNA微阵列检测肝癌细胞的整体circRNA表达谱分析发现hsa_circ_0004018在肝癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织，且hsa_circ_0004018可能通过与miRNAs的相互作用参与癌症相关的途径。Ren等[39]检测到了127个差异表达的circRNA和3 235个差异表达的mRNA，选择前5个上调的circRNA构建circRNA-miRNA-mRNA网络,发现它们参与p53、血管生成和细胞周期等与癌症相关的信号通路；通过受试者工作特征曲线分析显示circZFR、circFUT8、circIPO11可以显著区分癌症样本，表明circRNA-miRNA-mRNA网络有助于了解肝癌肿瘤进展的分子机制。目前circRNA在肝癌中的作用机制尚不清楚，随着circRNA提取、检测技术的成熟，其有望成为早期诊断肝癌的标志和治疗的新靶标。

3 其 他

3.1 循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs) CTCs是指由癌组织脱落进入外周血的肿瘤细胞。已有研究表明，CTCs在肝癌早期即可进入血液循环，分散于患者的体内，当受到一定的因素刺激时，它们会被唤醒并增殖扩散到身体的其他部位或组织，引起肝癌的复发与转移，是预测肝癌患者预后的可靠生物指标。对此，Sun等[40]对123例肝癌患者的血清进行了研究，发现CTCs能准确地反映肿瘤细胞的分型及侵袭性，对肝癌的手术和术后治疗具有指导意义。曹宇勃和许崇安[41]对1 133例肝细胞癌患者的血清进行了荟萃分析，指出CTC阳性肝癌患者的总生存期和无复发生存期比CTC阴性患者差,进一步证实了测量外周血中CTCs对判断肝癌的临床预后具有重要意义。Ou等[42]发现CTCs表型可作为肝癌患者的预后指标，通过用上皮-间质转化标记CTCs异质性发现间充质CTCs与高AFP水平、多瘤、栓子或小栓子的存在、早期复发有显著相关性，其次是混合表型CTCs、上皮CTCs。因此，监测体内CTCs对肿瘤的早期诊断、治疗、预测复发转移、提高患者预后等均具有指导意义。

3.2 循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)甲基化 ctDNA是一种存在于血液、脑脊液等体液中的细胞外DNA，主要来自坏死或凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞外泌体及CTCs[43]。DNA甲基化是DNA的共价修饰，在维持细胞正常功能、胚胎发育及遗传过程中均发挥重要作用，异常的DNA甲基化是导致许多疾病发生的分子基础[44]。近年来研究表明ctDNA甲基化在筛查、诊断及治疗癌症中的作用均具有很大优势。Xu等[45]研究发现ctDNA甲基化标志物对肝癌诊断的灵敏度和特异度分别为85.7%和94.3%，漏诊率较AFP降低50%以上，并且建立了肝癌综合诊断模型cd-score，此模型与传统的肝癌监测方法相比具有如下优势：①对肝癌诊断具有较高的灵敏度和特异性，可以有效鉴别诊断肝癌与其他肝脏疾病；②具有实时、动态地监测肿瘤分子变化的功能；③可以检测到在影像学上不明显或不确定的肿瘤；④微创且价廉，适用于临床推广。上述研究表明，ctDNA甲基化可作为评估肝癌的优良生物标志物，具有较为广阔的临床应用前景。

4 结 语

基因组学实验技术和生物信息处理技术的快速发展促进了新型生物标志物的研发，并在近年来取得了很多重大突破。除深入探讨AFP、脱-γ-羧基凝血酶原、α-L-岩藻糖苷酶等经典标志物，一些新型生物标志物(包括miRNA、circRNA、DKK-1、Hsp90α、CTCs、SCCA、GPC3、骨桥蛋白等)也被进一步了解。然而，理想的肝癌生物标志物应该为肝癌所特有，敏感性高，能在肝癌发生的早期被检出，大多数现有的标志物无法达到这一标准。为了提高肝癌的早期诊断率，保障患者的生存质量，很多学者使用不同的生物标志物和AFP检测相结合，有效降低了疾病的漏诊率和误诊率。现有研究认为，生物标志物并不局限于肝癌的早期筛查和诊断，如AFP mRNA、骨桥蛋白、CTCs等在肝癌的复发转移中也起重要作用，成为评估其预后的重要生物学标志物。期望结合物理、化学、基因组学和生物信息学等先进技术，将研究成果转化为临床，从而为癌症患者带来益处。