苯乙醇胺A荧光免疫层析试纸条的制备及特性

郭会灿，李君华，王丽君，李春生,*

（1.石家庄职业技术学院食品与药品工程学院，河北 石家庄 050000；2.河北省科学院生物研究所，河北 石家庄 050000）

苯乙醇胺A（phenylethanolamine A，PEAA）又称为克伦巴胺，其分子式为C19H24N2O4，一般以盐酸盐的形式存在，属于人工合成化学物质。PEAA与莱克多巴胺和盐酸克仑特罗属于同类物质，均属于β2-激动剂的一种，长期使用可以增加瘦肉率并缩短出栏周期。PEAA在体内具有蓄积性，人长期食用可出现肌肉震颤、头晕等症状，可诱发高血压、心脏病等[1-3]。

农业部第1519号公告《禁止在饲料和动物饮用水中使用的物质》[4]宣布，PEAA被列入禁止添加剂，并应加强市场监管，严厉打击非法滥用瘦肉精类物质。PEAA属于一类新型的化学物质，关于PEAA的研究报道较少，对于PEAA的检测方法目前还不成熟。目前，PEAA的常用检测方法主要有气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法[5-7]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8-10]和酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法[11-13]，这些方法虽然灵敏度高、准确性好，但是需要精密的仪器设备和专业的操作人员，且检测成本高，适合用于验证实验[14-16]，不适合基层的初筛工作。近年来，随着荧光免疫层析技术的不断成熟，再加上其灵敏度高、准确性好、能够定量的特点，被广泛用于各类兽药残留的检测研究中[17-19]。李丹妮等[20]制备β-受体激动剂荧光免疫层析试纸条，克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇试纸条的检测下限分别可达0.2、0.4、0.5 μg/L。李静宇等[21]制备克伦特罗荧光免疫层析试纸条，检测限可达0.35 μg/L。而PEAA作为一种新型的β2-激动剂，目前的研究还处于初期阶段，尚未见关于PEAA荧光免疫层析法的研究报道。

本研究采用重氮化法合成PEAA人工抗原，通过免疫BALB/c小鼠，融合筛选得到高特异性、高效价的抗PEAA单克隆抗体，并建立PEAA荧光免疫层析方法，通过对其灵敏度、特异性和准确度进行评价，建立一种高灵敏度、高特异性、快速、准确测定PEAA的荧光免疫层析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BALB/c小鼠来自河北省科学院生物研究所。

PEAA（纯度≥98.0%）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美国Sigma公司；甲醇、盐酸、氨基磺酸、亚硝酸钠、N,N-二甲基苯胺、锌粉、水合肼、尿素、钯碳催化剂（均为分析纯） 天津大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

722紫外-可见分光光度计 上海光学仪器厂；TDZ4-WS台式低速自动离心机 湖南湘仪仪器有限公司；T-Meter Ⅰ荧光免疫分析仪 河北特温特生物科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重氮化法制备免疫抗原

重氮化法[22]制备免疫抗原PEAA-BSA：1）将6 mg PEAA溶于15 mL乙醇，持续搅拌，当温度升至80 ℃时，加入28 μL水合肼和10 mg钯碳催化剂，还原反应10 h，用硅胶薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）监测，之后真空抽滤去除溶剂，得到黄色粗品，即PEAA-NH2；2）称取上述PEAA-NH29.6 mg，溶于300 μL水中，加入3.1 mg/100 μL的NaNO2溶液300 μL，溶液用0.2 mol/L HCl调节pH值至1.5，4 ℃暗处反应7 h；3）反应过程用N,N-二甲基苯胺进行监测，用质量浓度为55 mg/mL的尿素溶液中止反应；4）将90 mg BSA溶于1.5 mL PBS中，边加边搅拌，溶液pH值用1 mol/L NaOH调至7.5，反应3 h，得到偶联物PEAA-BSA；5）偶联物PEAA-BSA经低浓度PBS透析72 h，期间换液6 次，3 000 r/min离心即得PEAA-BSA。PEAA-BSA的合成路线图如图1所示。

1.3.2 免疫抗原的鉴定

1.2.2.1 紫外扫描

在200～700 nm波长范围内扫描PEAA、BSA及偶联物PEAA-BSA，以确定是否成功偶联。

1.2.2.2 偶联比测定

BSA和PEAA质量浓度测定均采用标准曲线法，偶联比按照公式（1）计算[23]。

式中：A为吸光度；ρ为质量浓度/（mg/mL）。

1.2.2.3 免疫

采用传统免疫方法，用合成的PEAA人工抗原免疫BALB/c小鼠。共进行4 次免疫，断尾取血，测定效价，选取效价高的小鼠采用传统方法进行融合，制备抗PEAA单克隆抗体。

1.3.3 荧光微球（quantum dot submicrobeads，QBs）标记PEAA单克隆抗体

采用1-乙基-3-（3’-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐-N-羟基丁二酰亚胺（1-ethyl-3-（3’-dimethylaminopropyl）-3-ethyl-carbodiimide-N-hydroxysuccinimide，EDC-NHS）法偶联QBs和PEAA抗体[24]：取20 mg QBs加入到5 mL 2-（N-吗啉）甲磺酸水合物（2-（N-morpholino） ethanesulfonic acid hydrate，MES）缓冲液（0.1 mol/L，pH 5.5）中，混匀后10 000 r/min离心30 min；收集沉淀，加入1 mL MES缓冲液重悬，分别加入40 μg EDC和50 μg Sulfo-NHS溶液，37 ℃振荡反应1 h后，10 000 r/min离心30 min；收集沉淀，加入1 mL 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）缓冲液重悬；将PEAA抗体加入到上述溶液中，37 ℃反应2 h，然后加入含有10% BSA的PBS溶液封闭2 h，得到用QBs标记的PEAA抗体产物，简称QBs探针，4 ℃贮存，备用。

1.3.4 QBs荧光免疫标记试纸条的组装

QBs荧光免疫试纸条由5 个部分组成，分别为样品垫、结合垫、硝化纤维素（nitrocellulose，NC）膜、吸水垫及聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）底板。将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫依次黏贴在PVC底板上，将适当浓度的PEAA和羊抗鼠二抗喷涂在NC膜上，分别作为检测线（T线）和质控线（C线），结合垫上包被QBs探针。

1.3.5 PEAA荧光免疫层析试纸条性能测试1.3.5.1 检测范围和检测限测定

将PEAA标准品用阴性尿液稀释成质量浓度分别为0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L的系列标准溶液，采用本研究中的荧光免疫层析试纸条和荧光免疫分析仪进行测定，每个质量浓度重复测定10 次，取其平均值。以PEAA的质量浓度为横坐标，以B/B0（B为不同质量浓度PEAA测定所得T/C值，B0为质量浓度0 μg/L时测得的T/C值）为纵坐标，绘制拟合曲线。测定20 份阴性尿液，将“平均值+3 倍标准差”作为荧光免疫层析试纸条的检测限[25]。

1.3.5.2 准确度测定

通过添加回收实验测定荧光免疫层析试纸条的准确度[26-28]。取9 份阴性尿液样本，加入质量浓度分别为0.5、4.5、13.5 μg/L的PEAA，用荧光免疫层析试纸条和荧光免疫分析仪进行测定，计算回收率的平均值和变异系数（coefficient of variation，CV），分析准确度。样品均重复测定10 次。

1.3.5.3 精密度测定

通过批内和批间差来测试本研究中荧光免疫层析试纸条的精密度[29-31]。取阴性尿液样本，加入不同量的PEAA标准品，配制成PEAA质量浓度分别为4.5、13.5 μg/L的尿液，取同一批次荧光免疫层析试纸条10 条，分别对2 个质量浓度的样本进行重复测定；再取3 个不同批次荧光免疫层析试纸条各10 条，分别对2 个质量浓度的样本进行测定，计算CV平均值，分析批内和批间的测定精密度。

1.3.5.4 特异性测定

在阴性尿液中分别添加克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、福莫特罗和PEAA，使其终质量浓度为100 μg/L，用PEAA荧光免疫层析试纸条进行测定。交叉反应率按照公式（2）计算。

式中：ρ为实测质量浓度/（μg/L）；ρ0为添加质量浓度/（μg/L）。

1.4 数据处理

采用SPSS统计软件进行数据处理，Origin制图软件绘制标准曲线[32-33]。

2 结果与分析

2.1 抗原合成鉴定

2.1.1 紫外扫描鉴定合成的人工抗原

将PEAA、BSA和偶联物PEAA-BSA分别稀释到同一质量浓度，进行紫外扫描。由图2可知：BSA含有酪氨酸，决定了其特征吸收峰在278 nm波长处；PEAA的特征吸收峰也在278 nm波长处；基于叠加原理，二者的偶联物PEAA-BSA的特征吸收峰也在278 nm波长处，且在320 nm处有氮氮双键（－N＝N－）特征吸收峰，且溶液颜色变为黄色，表明偶联成功。

2.1.2 偶联比测定

2.1.2.1 PEAA标准曲线的制作

PEAA的最大吸收波长为278 nm，在220～525 nm波长范围内对PEAA倍比稀释溶液进行紫外扫描，得到PEAA的标准曲线方程为y=1.099 2x+0.020 5（r=0.996）。

2.1.2.2 BSA标准曲线的制作

BSA的最大吸收波长为278 nm，对BSA倍比稀释后，分别在220～525 nm波长范围内进行紫外扫描，得到扫描曲线。经测定，合成的PEAA-BSA质量浓度为2.7 mg/mL，故BSA质量浓度为0.278 8 mg/mL。带入BSA的标准曲线方程y=0.141 0x+0.007 2（r=0.995），得到吸光度为0.046 5。

2.1.2.3 PEAA-BSA偶联比计算

由图3可知，重氮化法得到的PEAA-BSA的最大吸收波长为278 nm，对应的吸光度为0.372，带入PEAA的标准曲线方程，得出PEAA的质量浓度为0.277 5 mg/mL，偶联比=19.1∶1.0。Erlanger[34]认为，PEAA和偶联蛋白的结合比在8～25之间是比较适合的。

2.2 效价测定

表 1 间接ELISA法的效价测定结果Table 1 Titer determination by indirect ELISA

通过间接ELISA法测定小鼠的血清效价，评价抗体和抗原的特异性结合情况。由表1可知，采用人工合成的PEAA抗原免疫小鼠后，效价最高达1∶204 800，特异性良好。

2.3 PEAA荧光免疫层析试纸条的性能测定结果

2.3.1 标准曲线的建立

绘制得到的标准曲线方程为y=－1.444 5x+2.495 2（R²=0.992 9），线性关系良好。20 份阴性尿液的测定结果平均值为0.426 μg/L，标准差为0.02，因此尿液样本的检测限为0.496 μg/L。

2.3.2 准确度

表 2 回收率实验结果Table 2 Recovery of the method

由表2可知，测定回收率在90%～120%之间，CV在10%以内，能满足试剂盒的测定性能要求。

2.3.3 精密度

由表3可知，批内CV均在4.0%～8.0%之间，小于10%，批间CV也在10%以内，能满足试剂盒的测定性能要求。

表 3 批内及批间精密度测定结果Table 3 Intra-batch and inter-batch precision

2.3.4 特异性

表 4 交叉反应实验结果Table 4 Cross-reactivity

由表4可知，各类似物的添加质量浓度为100 μg/L时，用PEAA荧光免疫层析试纸条测定，PEAA与其他类似物的交叉反应率均小于5.00%，表明PEAA荧光免疫层析试纸条的特异性良好。

3 结 论

PEAA已经成为研究比较热门的一种新型瘦肉精，建立检测PEAA的快速检测方法，有助于进行基层检测，保障肉类食品安全，从源头把控食品质量。荧光微球作为一种新型标记物，能够直接标记抗体，反应时间短，灵敏度高，因此在免疫层析技术中被广泛应用。

抗原-抗体的结合特异性是实现免疫学检测的关键，抗原决定簇决定了免疫产生抗体的基本特性，而制备的抗体效价对检测方法灵敏度的影响十分重要。本研究通过重氮化法合成PEAA人工抗原，通过效价检测，得到高效价PEAA抗体。在此基础上以QBs为探针，成功将QBs与PEAA抗体偶联，制备得到PEAA荧光免疫层析试纸条，该试纸条的检测限为0.496 μg/L，灵敏度高于胶体金免疫层析法，且在荧光免疫法定量检测尿液中的PEAA物质中取得了突破性进展，该试纸条的灵敏度和特异性都很好，能够为免疫技术的开发提供参考。