急性脑出血瘀热病机生物标志物的血浆差异代谢组学研究＊

杨晓娟，高觉民，张 宁，杨诗锦，杨东清，于 明，田 婷，李国春＊＊

（1.南京中医药大学公共卫生学系 南京 210023；2.南京中医药大学附属江苏省中医院神经外科南京 210029；3.邳州市中医院神经内科 徐州 221300；4.江苏大学附属江滨医院神经内科 镇江 212001：5.南京中医药大学附属南京市中医院急诊科 南京 210001）

脑出血是指脑动脉、静脉或毛细血管破裂导致脑实质内的出血[1]。因其高发病率、高致残率及高病死率，已成为危害人类健康最主要的疾病之一[2]。根据2018 年中国脑血管病防治指南，每年新发脑卒中200万人，死于脑血管疾病150万人。急性脑出血占中国脑卒中的17.1-55.4%，发病率远高于西方国家[3]。目前，手术治疗虽可取得一定疗效，但患者预后仍不佳。脑出血因其复杂未知的发病机制和迅疾的发病速度，加之缺乏有效治疗手段，其致残率、死亡率始终居高不下[4]。瘀热是脑出血急性期以“瘀”与“热”两种病理因素互相胶结而成的具有新特质的复合病理因素[5]。国医大师周仲瑛教授认为“瘀热”是脑出血急性期首要的核心病理机转，风、痰、火、虚，皆因“瘀热”而起。因此，“瘀热阻窍”是脑出血急性期的基本病机[6]。根据脑出血“瘀热”病机理论进行论治，能够取得显著疗效[7][8]。脑出血急性期“瘀热”深浅与患者预后密切相关，但对于“瘀热”病机的诊断目前基于专家经验和主观指标构成的量表，尚缺乏客观量化和敏感的特异性指标。

代谢组学属于系统生物学的新兴发展领域，旨在测定尽可能多的小分子代谢物，这些代谢物多处于生命活动调控的末端，可对相关细胞的整体生命活动和疾病的状态有一个清晰全面的阐述[9]。已有研究表明，脑出血后的继发性损伤由血红素氧化酶-1通过多种代谢物发挥作用，但相关代谢物的具体作用途径仍复杂不明[10]。同时，脑出血的病理变化与氨基酸代谢、糖异生、脂肪酸代谢等通路息息相关[11]。先前也有学者做过脑出血与脑梗死的代谢组学鉴别，并证实其为预测脑出血的快速、及时的工具[12，13]。本研究以图6实验流程所示，采用差异代谢组学的方法筛选和评价急性脑出血“瘀热”病机的生物标志物，并探讨基于瘀热病机的脑出血体内动态变化。

1 资料和方法

1.1 样本收集

患者资料来源于江苏省中医院神经外科和江苏大学附属镇江市江滨医院神经内科。纳入本研究的ICH急性期患者（n=80）年龄40-80 岁，男女不限；符合西医脑出血急性期诊断标准，中医辨证分型参照《瘀热病机证候量化诊断标准评分表》，若量表评分总分大于10分即诊断为瘀热型，其中瘀热型和非瘀热型各40例；患者发病48 小时内入院。同时收集健康志愿者(n=40)血样作为对照。瘀热型、非瘀热型和健康组按照年龄、性别进行匹配。本研究得到了南京中医药大学附属医院伦理委员会审批（No.2014NL-037-02），且所有研究对象必须签署知情同意书。急性脑出血患者于入院次日上午7:00 时抽取空腹静脉血2 mL，于EDTA抗凝管中，室温静置2 h 后，4℃，1 000 r·min-1离心20 min，用加样器吸取血浆，按每管300 μL 分装成数管，-80℃冷冻备用，健康对照组血样采集和处理同上。

1.2 仪器和试剂

Q-Exactive 高分辨质谱系统（美国Thermo 公司）；配UPLC 超高效液相系统（美国Waters 公司）；Xcalibur数据采集软件（美国Thermo 公司）；Centrifuge 5424R离心机（德国Eppendorf 公司）；CentriVap 离心浓缩仪（美国Labconco 公司）；Kylin-bell VORTEX-5 涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；乙腈、甲醇、色谱纯（德国Merck 公司）；蒸馏水（香港屈臣氏公司）；甲酸、碳酸氢铵（美国Sigma公司）。

1.3 样品准备

将上述血浆样本解冻，冰上操作，移取血浆样品100 μL于1.5 mL Ep管中，加400 μL冷乙腈（含内标），涡旋振荡1 min，室温下静置10 min，4℃条件下以14 000 g 离心15 min。取上清液，冻干，-20℃保存。QC样品由每个实际样品取10 μL 混合制得，将血浆冻干提取液复溶于100 μL 的20%甲醇/水溶液中，然后进行色谱分析。

1.4 LC/MS条件

反相色谱-正离子质谱模式如下：色谱柱为BEH C8 柱（1.7μm，2.1×100 mm）；柱温50℃；进样体 积10 μL；流动相：A 相，水（含0.1%甲酸）；B 相，乙腈（含0.1%甲酸）；流速0.35 mL/min；5% B 为起始浓度(1～24 min)，B 相升为100%，平衡至27.5 min，27.6 min 时B相降为5%，平衡至30 min；质谱条件：采用加热电喷雾离子源HESI-Positive 模式，一级全扫描+DDA 二级子离子扫描模式；反相色谱-负离子质谱模式如下：色谱柱为BEH T3 柱（1.8 μm，2.1×100 mm，美国Waters 公司）；柱温50℃；进样体积10 μL；流动相：A 相，水（含6.5 mM 碳酸氢铵）；B 相，95%甲醇/水（含6.5 mM 碳酸氢铵）；流速0.35 mL/min；5%B为起始浓度（1-18 min），B 相升为100%，平衡至22 min，22.1 min 时B 相降为5%，平衡至25 min；质谱条件：采用加热电喷雾离子源HESI-Negative 模式，一级全扫描+DDA 二级子离子扫描模式。在以70-1 000 m/z于扩展的动态范围（2 Ghz）的全扫描模式下，以氮气为雾化气体（8 L/min，350℃），用正电喷雾模式采集数据。毛细管电压为3 800 V，毛细管温度为320℃。

1.5 代谢物鉴定与通路分析

采用Xcalbur 数据分析软件收集结果，运用OSI/SMMS 定性分析软件（大连达硕信息技术有限公司）、HMDB 和Metabolites Biological Role 对提取的分子特征进行非靶向代谢组学分析。

1.6 数据处理和统计分析

采用SIMCA 软件（版本14.0）进行多变量统计分析,包括主成分分析（PCA），偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），提供模型参数和VIP 值。运用R 语言（版本3.6）进行火山图、热图、t-test 单变量统计分析，采用SPSS 软件（版本21.0，IBM）以ROC 曲线评价代谢物的灵敏度和特异性，应用Logistic回归分析对筛选的代谢物进行综合评价。

2 结果

2.1 健康组、非瘀热组与瘀热组之间得分比较 2.1.1 PCA得分

图1 健康组、ICH急性期非瘀热组和ICH急性期瘀热组的多变量统计分析

采用PCA 降维方法对健康组、非瘀热组和瘀热组之间的差异代谢物进行分析。结果如图1A所示，PCA模型在第4 个主成分达到最大（R2X=0.384，Q2=0.299），结果显示ICH 患者和健康受试者分布于两个独立区域，表明ICH 患者与健康组之间存在显著代谢差异。

2.1.2 PLS-DA得分与置换检验

图2 OPLS-DA评分图

图3 ICH急性期非瘀热组和ICH急性期瘀热组之间的多变量统计分析

PLS-DA 分析结果如图1B 所示，模型在第5 个主成分达到最大，（R2Y=0.826，Q2=0.691）显示非瘀热组和瘀热组之间轮廓分离逐渐明显。ICH患者和健康人的置换检验验证模型（图1C、图1D、图1E），确保模型未过拟合。图3A（R2Y=0.61，Q2=0.61）显示非瘀热组与瘀热组趋势分离，表明当前模型可用于解释和预测。

2.1.3 OPLS-DA得分与置换检验

OPLS-DA 得分图显示健康组、瘀热组、非瘀热组三者呈现完全独立的区域（图1F，R2Y=0.944，Q2=0.745）。两个独立的监督模型（OPLS-DA）证明瘀热组与健康组之间以及非瘀热组与健康组之间各自存在显著差异（图2A，R2Y=0.91，Q2=0.93；图2B，R2Y=0.92，Q2=0.92）。非瘀热组和瘀热组两个群体亦基本分布于PC1两侧（图3B，R2Y=0.73，Q2=0.63），置换检验结果为R2=0.33，Q2=-0.55（图3C）。

2.2 差异代谢物及涉及通路

2.2.1 瘀热组与健康组、非瘀热组与健康组

OPLS-DA 的VIP 值（＞1.5）与学生t检验结果相结合，初筛与脑出血相关的代谢产物（表1）。得出瘀热组与健康组之间差异代谢物27个，非瘀热组与健康组之间差异代谢物23 个。二者共有代谢产物20 个，其中酯类以上调为主，如异紫花前胡内酯、没食子酸酯、10-脱氧甲炔内酯；类固醇激素类及其中间产物上调，如19-羟基-17-氧代雄甾-5-烯-3-β-基硫酸盐、孕酮。此外，SP 600125、甲基异丙胺磷、麦角硫氨酸显著上调；油基乙醇胺显著下调。若只考虑统计意义可见大量脂肪酸下调（表S1），有戊烯酸、异甘草酸、7-氧代十二烷酸、9-癸烯酸、DL-2-氨基辛酸等。

2.2.2 非瘀热组与瘀热组

非瘀热组与瘀热组之间的血浆差异代谢物为14个（表2），主要与氧化应激、促凝作用、细胞凋亡、抗炎效应相关。上调产物有间苯二酚，下调产物有燕麦蒽酰胺E、可的松21-乙酸酯、丙基三甲基甜菜碱、淫羊藿苷A、酸甲酯、甘油三酯等。代谢产物所涉及的通路有类固醇激素合成、组氨酸代谢和半乳糖代谢等（表3、图4）。

表1 急性ICH瘀热组、急性ICH非瘀热组分别与健康组之间的血浆差异代谢物

表2 急性ICH非瘀热组与瘀热组的血浆差异代谢物

表3 非瘀热组与瘀热组之间血浆差异代谢物涉及的代谢途径

图4 代谢通路

2.3 ICH瘀热病机的潜在生物标志物

对非瘀热组与瘀热组的三个差异代谢物可的松21-乙酸酯、酸甲酯和甘油三酯进行联合ROC 曲线分析得出：曲线面积为0.91，敏感度85%，特异性82.5%（图5），可作为瘀热病机急性ICH的组合诊断因子。

3 讨论

本研究运用非靶向代谢组学的研究方法，建立了急性脑出血瘀热病机相关的一系列差异代谢物，包括酯类、脂肪酸类、酚类等化合物。现就其进行进一步探讨，并寻找与瘀热发病机制相关的潜在生物标志物。

3.1 酯类

图5 可的松21-乙酸酯、酸甲酯、甘油三酯的联合ROC曲线（联合因子）

图6 急性脑出血瘀热病机生物标志物研究流程图

酯是羧酸或无机含氧酸与醇发生酯化而成的产物，与健康组相比，ICH 患者酯类多为上调，且瘀热组更为显著。非瘀热组/瘀热组中的酯类化合物多为下调，说明酯类合成增强不仅与ICH 急性期有关还可能与此期间的瘀热产物相关。不同的是，没食子酸酯却在非瘀热组上调更为显著，它可以降低IL-6、TNF-α和Aβ对神经细胞的毒性作用，并升高IL-2 水平[14]，同时激活细胞的抗氧化防御系统，减少Aβ引起的细胞氧化损伤和细胞凋亡[15]，故抑制炎症因子趋化和诱导抗氧化物合成可能有助于减少瘀热相关产物的生成。异紫花前胡内酯显著抑制VEGF-A 诱导的血管内皮细胞增殖、迁移、侵袭和微血管生成[16]，以抑制活跃的血管内皮生长因子进一步阻止血管通透性增强。与健康组相比，它在瘀热组上调更高，提示瘀热病机面临的脑血管损伤威胁更大。但同时异紫花前胡内酯对NE、KCl 收缩的血管环有舒张作用，且去除内皮后舒张作用不受影响[17]。说明异紫花前胡内酯还有直接作用于血管平滑肌的非内皮依赖性舒张作用，这又会增加二次出血的可能性，因此瘀热病机的脑出血更为凶险，且该代谢物在急性ICH 中的利弊尚待研究。可的松21-乙酸酯是氢化可的松合成过程中的中间产物，它的出现提示体内糖皮质激素的分泌。氢化可的松可介导内米松N 抑制hPDL 细胞分泌IL-6 和肿瘤坏死因子-α[18]，又可在大叶性性肺炎中直接降低血清IL-6 的水平[19]。作为非瘀热与瘀热组间的差异代谢物，其下调说明瘀热状态存在更剧烈的炎症反应，或许可以考虑作为反映瘀热病机炎症因子趋化动态的生物标志物。丙基三甲基甜菜碱作为胆碱的氧化代谢产物，其去甲基后生成甘氨酸。甘氨酸是抑制性神经递质，也是还原性谷胱甘肽的组成氨基酸，发生严重应激时常用于机体补充[20]，故甘氨酸代谢可能是ICH 瘀热病机涉及的通路之一。同时，甜菜碱可有效降低小鼠血浆高S-腺苷同型半胱氨酸水平，升高S-腺苷蛋氨酸水平，从而缓解高S-腺苷同型半胱氨酸诱导的动脉粥样硬化[21]。又可降低氧化损伤的HUVEC 细胞IL-6、IL-8 和TNF-α等炎症因子的含量，甚至高脂小鼠的肝脏比率、总胆固醇和甘油三酯含量[22，23]。因此，除了抗炎作用外，甜菜碱含量下降反映瘀热病机可能还与脑血管硬化程度及血脂水平有关。5-羟色胺是一种由脑部5-HT 神经元、胃肠道的胃窦细胞、肺部或其他一些外围器官产生的活性物质，也是在大脑皮层质与神经突触内分布较多的抑制性神经递质，它在外周组织可刺激血管和平滑肌强烈收缩[24]。利血平的一种衍生物即是酸甲酯[25]，而利血平可抑制5-羟色胺在血小板和肥大细胞颗粒中的储存[26]。故酸甲酯可能是5-羟色胺上游产物并有助于释放该神经递质，并根据调节5-羟色胺的释放进一步调控cAMP和JNK信号通路。酸甲酯的下调说明5-羟色胺释放减少并伴随脑血管收缩能力减弱，同时也意味减少了JNK 介导的细胞凋亡，从舒缩脑血管和细胞凋亡角度可以考虑作为ICH 瘀热病机的某一标志物。血浆甘油三酯是促进动脉粥样硬化的风险因子[27]，主要存在于富含甘油三酯脂蛋白中[28]，脂蛋白脂酶会进入血液循环形成二聚体，后落于毛细血管腔面发挥水解甘油三酯的作用，继而降低循环中甘油三酯脂蛋白水平[29]。相较于瘀热组，甘油三酯在非瘀热组显著下降，提示基于瘀热病机的脑出血机体脂蛋白脂酶活性受到一定程度的抑制，甘油三酯或可从预示脑血管硬化角度作为瘀热病机的潜在标志物。

3.2 脂肪酸类

脂肪酸在生理状态下是脂肪代谢的中间产物，可为人体提供重要能源。实验证明血浆脂肪酸浓度升高可通过蛋白激酶介导的炎性反应信号通路引发内皮损伤[30]，且血清脂肪酸的浓度也是诱发高血压的重要危险因素[31]。与健康组相比，DL-2-氨基-3-膦丙酸、戊烯酸、冬青叶豚草酸等含量均下调，说明ICH 急性期机体处于应激状态，糖供能不足后脂肪酸被大量使用，生成乙酰CoA 进入三羧酸循环进行氧化供能。诃子次酸能阻止甘油糖基化终产物并诱导LX2 细胞生成活性氧，也能防止ERK-磷酸化介导Nrf2 核易位导致的胶原蛋白积聚，以此提高抗氧化蛋白的产生[32]。它作为只出现在瘀热组/健康组中的酚酸，含量显著上调提示瘀热机体存在更严重的氧化应激，针对其治疗或许可将抗氧化蛋白作为一个切入点。丙酸氧化生成丙酰CoA，经羧化及异构酶作用转为琥珀酰CoA，最后参加三羧酸循环而被氧化。在非瘀热组/瘀热组中丙酸含量明显降低，提示瘀热病机下产生的瘀血、痰浊、内风等病理产物可能阻碍了三羧酸循环的某一环节，从而降低丙酸利用率。噻唑烷羧酸类的合成多以半胱氨酸为前体[33]，血浆同型半胱氨酸水平与高血压脑出血的发生、高血压级别密切相关，其水平与高血压脑出血患者血压分级呈正相关[34]，4-噻唑烷羧酸在非瘀热组下调提示ICH 瘀热机制下的半胱氨酸降解可能被抑制。

3.3 酚类

γ-生育酚的抗炎和抗氧化是由其代谢产物γ-CEHC 介导，尤其在高糖环境中，γ-CEHC 通过保留NO 生物利用度而改善由高血糖引发的血管功能障碍[35]。γ-CEHC 是瘀热/健康组的差异代谢物，其下调说明瘀热病机与机体NO 的堆积有关。而NO 利用度降低又会通过氧化应激、脂质浸润、炎症因子及血管改变等参与动脉粥样硬化[36]。苯乙基间苯二酚能够对抗细胞的氧化损伤[37]，或许间苯二酚与之具有类似作用。其在ICH 急性期下降，尤在瘀热组更为显著，故脑出血初始阶段可能面临广泛的细胞损伤，且瘀热发病机制加大该损伤力度。燕麦蒽酰胺E作为食源性代谢物是燕麦中特有的抗氧化酚类化合物[38]，通过降低IL-1 刺激的ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-8 和MCP-1等黏附分子的分泌来抑制内皮细胞间作用，证明参与抗炎和抗动脉粥样硬化[39]。结果中燕麦蒽酰胺E 下调且表现出较高的AUC 值，说明非瘀热型的机体氧化应激和脑血管粥样硬化病变程度相对瘀热型较为轻缓。

3.4 其他

脑组织几乎完全靠葡萄糖供能进行神经活动，血糖供应不足会使神经功能受损。葡萄糖可经过糖酵解、三羧酸循环或生物氧化过程生成CO2和水，释放出更多能量。DTDP-4-脱水-6-脱氧-α-D-葡萄糖显著降低，说明葡萄糖分解增强，瘀热组耗能更多。脑出血后由于机体代谢异常会产生多种生物活性物质如内皮素、NO、组胺、花生四烯酸及毒性产物氧自由基。麦角硫氨酸直接受EGT 2 的调控参与组氨酸代谢，是一种属于非酶抗氧化系统的亲水性氨基酸，在人体内可以对细胞起到保护作用[40]。有研究表明，麦角硫氨酸在体外对靠FFA 诱导其脂质毒性的C2C12 细胞具有保护作用[41]，并发现麦角硫氨酸降低MAPK 级联活性，对IL-6 有抗炎作用。在与健康组的比较中，麦角硫氨酸在瘀热与非瘀热组均大幅上调，尤在瘀热组表达更高，再次说明瘀热往往伴随更剧烈的氧化应激和炎症反应。同时，在更重要的神经保护方面，Yang 等人证明麦角硫氨酸对β淀粉样蛋白诱导的小鼠神经元损伤起保护作用[42]；还能明显提高D-半乳糖处理的C57BL/6J 小鼠的学习记忆能力[43]，显著降低海马β-淀粉样蛋白的积累，并能明显抑制脂质过氧化。甚至，通过Thr 389 磷酸化激活S6K1 和诱导NT5 激活TrkB信号，进而促使体外培养的NSCs神经元分化[44]。由此看来，麦角硫氨酸显著上调，除了抗炎外，更主要的可能是参与急性期脑组织损伤后神经细胞的再生和脑活动的网络重建，或许可作为未来神经组织再生方面研究的切入点。淫羊藿苷A 属于植物淫羊藿中的黄酮类组分，淫羊藿苷参与降血压、减轻脂质过氧化及通过血脑屏障发挥抗神经炎症作用[45][46][47]，可抑制炎性介质如TNF-α、IL-1β、COX-2 的mRNA 和蛋白的表达，从而减轻大脑神经炎症[48]。另淫羊藿苷减少大鼠大脑皮质Caspase-3蛋白表达[49]，提示有助于抑制神经细胞凋亡。但其体内来源尚不清楚，在非瘀热组/瘀热组中含量的下降反映了与血压下降、凋亡减少、过氧受限、炎症减轻等多方面相关。

3.5 通路分析

氨基酰基-tRNA 生物合成的通路变化意味瘀热病机下机体内氨基酸合成的改变。生物体内的转录翻译由tRNA 分子与相应氨基酸结合，并运送至核糖体进行蛋白质合成。氨基酸与tRNA 形成的氨酰-tRNA 键，对蛋白质合成的转运过程起关键作用[50]。若氨基酰基-tRNA 生物合成受阻，则会引起相关蛋白合成障碍。非瘀热组/瘀热组中的代谢通路变化涉及亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甘氨酸、脯氨酸等多种氨基酸，提示急性ICH 瘀热病机可能涉及大范围蛋白转录翻译过程的改变。

4 结论

国医大师周仲瑛教授认为，瘀热阻窍是脑出血急性期的基本病机病证，是由瘀血和火热两种病理因素共同参与，以致瘀热相搏，冲激上逆，损伤脉络，络破血溢，脑中蓄血，是导致风、火、痰、虚等多种病理因素的基础，多出现在疾病的危重阶段。本研究通过对急性脑出血的瘀热病机进行血浆代谢组学分析，发现瘀热病机往往伴随程度更严重的氧化应激、炎症反应、血管硬化、细胞凋亡。得到的可的松21-乙酸酯、酸甲酯和甘油三酯可作为一组急性脑出血瘀热病机的生物标志物。这些差异代谢物的发现不仅为基于瘀热病机的脑出血提供了针对治疗和有效预防，也为揭示瘀热病机的发生、发展和转归提供了新的依据。但本研究也有局限性：①血液样本仅收集于急性期，后期可对恢复期进行分析，从而揭示其生物标志物的动态变化；②单纯进行了血浆的代谢组学分析，后期可进行脑脊液、血清和脑组织样本的研究，以更全面准确揭示ICH瘀热病机的分子机制。