红景天苷对急性脑出血大鼠神经功能缺损评分与脑含水量的影响及其作用机制研究

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脑出血(ICH)是一种发病急，病情危重的疾病，其致残率和致死率非常高，严重影响人类的健康和生存质量。脑出血后再血肿形成过程中以及形成后，均存在水肿和炎症反应，对脑组织造成了进一步的损伤[1]。目前脑出血治疗缺乏有效手段，临床上主要采用降颅压、神经营养药物或者手术清除血肿等方式，但是由于脑出血后血肿周围组织损伤机制尚未清晰，所以尚未有特异的治疗方法。

红景天苷是中药红景天中最重要的有效成分之一。近年来人们对红景天进行了广泛的研究，发现其具有多种药理作用，如抗疲劳，防癌，促进血液循环，清除体内毒素等[2]。国内学者研究发现，红景天苷能够增加缺血脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)的含量，加速清除超氧阴离子自由基，降低脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量，具有减轻缺血脑组织乳酸中毒的作用[3]。本研究通过建立脑出血大鼠模型，研究红景天苷对脑出血大鼠脑组织是否具有保护作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠75只，雄性，SPF级，体重230～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于恒温恒湿环境中，常规饲料，自由饮水进食，昼夜各12 h，进行适应性饲养1周。

1.2 实验试剂 红景天苷(Salidroside)购自上海晶都生物技术有限公司；髓过氧化物酶(MPO)活性测定试剂盒购自Sigma-Aldrich公司；缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与血管内皮生长因子(VEGF)抗体购自Santa cruz公司；β-actin抗体购自碧云天技术公司。

1.3 实验分组 按随机数字表法将大鼠分为5组，每组15只。假手术组(Sham)、脑出血组(ICH)、药物低剂量组(Sal-L)、药物中剂量组(Sal-M)和药物高剂量组(Sal-H)。建立脑出血大鼠模型成功后，药物低剂量组、药物中剂量组和药物高剂量组分别给予红景天苷灌胃10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg，每日1次，共给药10 d，假手术组与脑出血组分别给予等量生理盐水灌胃，每日1次，共给予10 d。

1.4 脑出血大鼠模型建立 所有大鼠术前12 h禁食，6 h禁水，腹腔注射1%氯胺酮(30 mg/kg)进行麻醉，俯卧固定在立体定位仪上，大鼠前囟点与人字点在同一水平面，暴露颅骨，以前囟为原点，往后0.2 mm，左3 mm为穿刺点，牙科钻垂直钻穿颅骨，用微量进样针吸取2.5 μL Ⅶ型胶原酶，从钻孔点进针，深度约为6 mm，缓缓注入后，留针约5 min，推针，缝合。假手术组除不注射Ⅶ型胶原酶，其他操作同上。

1.5 神经功能缺损评分 建模成功的评分标准参照Longa方法[4]，分为5级：正常活动，无神经功能缺损记0分；瘫痪侧前肢不能充分伸展计1分；大鼠有向瘫痪侧旋转的行为计2分；向瘫痪侧倾倒计3分；无法自发行走，意识丧失计4分；对麻醉清醒后的大鼠进行神经功能评分。1～3分为造模成功，0、4分为造模不成功。

1.6 脑含水量 给药结束后，戊巴比妥腹腔注射过量麻醉，断头，快速取脑，去除嗅球、小脑、脑干和软脑膜后，迅速称量湿重，在95～100 ℃烤箱烘烤24 h至恒重，称量干重，计算脑组织脑含水量。

1.7 MPO活性测定 给药结束后，过量麻醉，断头，快速取脑组织，匀浆，取上清液，严格按照MPO试剂盒说明书要求，在25 ℃分光光度计460 nm波长处测定MPO活性，即每分钟降解1 μmoL时所需要过氧化物的量。

1.8 免疫印迹法检测相关蛋白表达 末次给药后，过量麻醉处死大鼠，剪取大鼠血肿周围脑组织，加入裂解液于冰上裂解30 min，12 000 r/min，4 ℃离心5 min，收集细胞，提取细胞总蛋白并定量，调整蛋白量。取等量裂解产物，上样，进行12%SDS-PAGE电泳。转膜，5%脱脂奶粉室温放置1 h，将膜于一抗中孵育4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加入对应二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，ECL化学发光法显色，运用Image J图像分析系统对每个条带进行灰度分析。

1.9 实时荧光定量PCR 获得大鼠血肿周围脑组织后，匀浆，严格按照说明书操作，加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，提取总RNA，逆转录酶催化合成cDNA，以cDNA为模板在聚合酶催化下进行PCR反应，HIF-1α引物：上游5′-CTTTCTTGGAAACGAGTGAAAGG-3′，下游5′-TGAGTAATTCTTCACCCTGCAG-3′；VEGF引物：上游5′- ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG -3′，下游5′- TCACCG CCTCGGCTTGTCACA -3′；GADPH引物：上游5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。94 ℃ 43 s， 61 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共34个循环，实验结果在荧光定量操作系统中进行分析对比，目标基因的相对定量用2-△△CT计算。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分 造模完成后，仅脑出血组出现2只大鼠死亡，已补充。脑出血组与给药组大鼠神经功能缺损评分均明显高于假手术组(P<0.05)；红景天苷各剂量组神经功能缺损评分低于脑出血组(P<0.05)，但高于假手术组。详见表1。

表1 各组神经功能缺损评分比较(±s) 分

与Sham组比较，1)P<0.05；与ICH组比较，2)P<0.05

2.2 各组大鼠脑含水量的变化 脑出血组大鼠脑含水量(85.25±0.68)%明显高于假手术组的(73.82±0.49)%；给予红景天苷处理后的大鼠脑含水量明显低于脑出血组大鼠(P<0.05)，药物低剂量组大鼠为(81.77±0.72)%，药物中剂量组大鼠为(78.29±0.68)%，药物高剂量组为(75.97±0.51)%，随药物剂量增大脑含水量逐渐下降。

2.3 各组大鼠脑组织中MPO活性变化 脑出血组与给药组大鼠脑组织中的MPO活性在给药5 d后达到峰值，随时间延长而略有下降，红景天苷处理后的大鼠脑组织中MPO活性显著低于脑出血组(P<0.05)，并随药物剂量增大，而MPO活性降低。详见表2。

表2 各组大鼠脑组织中MPO活性比较(±s) U/g

与Sham组比较，1)P<0.05；与ICH组比较，2)P<0.05

2.4 脑血肿周围组织HIF-1α和VEGF的蛋白表达 脑出血组大鼠脑血肿组织的HIF-1α和VEGF的蛋白表达明显高于假手术组(P<0.05)，采用红景天苷干预后的HIF-1α和VEGF的蛋白表达显著高于脑出血组，差异具有统计学意义，并随药物剂量增加而表达上调。详见图1。

与Sham组相比，*P<0.05；与ICH组相比，#P<0.05

2.5 脑血肿周围组织HIF-1α和VEGF的mRNA表达 脑出血组大鼠脑肿组织的HIF-1α和VEGF的mRNA表达明显高于假手术组(P<0.05)，采用红景天苷干预后的HIF-1α和VEGF的mRNA表达明显高于脑出血组，差异具有统计学意义。详见图2。

与Sham组相比，*P<0.05；与ICH组相比，#P<0.05

3 讨 论

本实验通过注射Ⅶ型胶原酶成功建立脑出血大鼠模型，采用给予不同剂量的红景天苷，发现大鼠的神经功能缺损评分明显低于不给药的大鼠，同时脑含水量下降，推断红景天苷对急性脑出血大鼠脑组织具有一定的保护作用。

髓过氧化物酶又称过氧化物酶，是血红素辅基的血红素蛋白酶，具有还原过氧化氢的作用，在成熟的粒细胞中，约占总蛋白质含量的5%，因此MPO活性可以用来测定中性粒细胞的数目。急性脑出血的早期会出现白细胞与中性粒细胞含量的升高，而研究表明白细胞与中性粒细胞计数的增高提示病情严重，预后差[5]。本研究结果显示，急性脑出血大鼠脑组织中MPO的活性显著上升，并随时间延长而略有下降，经过红景天苷处理后，大鼠脑组织中MPO明显低于脑出血大鼠，提示红景天苷可能对于脑出血炎症具有一定程度的抑制作用。

缺氧诱导因子-1α是受乏氧调节的亚基，对缺氧和常氧产生不同的生物效应，在正常状态下组织几乎不表达，但在低氧状态下，HIF-1α的表达增高，并与缺氧程度与缺氧时间相关[6]。HIF-1α的阳性表达率随脑出血时间延长而增加[7]，另外有调查指出缺氧诱导生成的HIF-1α具有保护脑组织损害的作用[8]。本实验结果显示，脑出血大鼠脑组织中HIF-1α的表达明显增加，而采用红景天苷处理后，血肿周围脑组织中HIF-1α的表达显著高于脑出血组，推测出现脑出血后机体中的HIF-1α会上调，HIF-1α具有保护脑组织免受损害的作用，提示红景天苷对脑出血后脑组织的损伤具有保护作用。

血管内皮生长因子是HIF-1α的目的基因，能增加微血管与小静脉血管的通透性。在血管形成之前，VEGF对神经系统具有直接的保护作用，研究表明具有一定的促神经再生作用，在脑缺血灶周脑组织中VEGF的表达显著上升，微血管密度显著增加，有效改善缺血半暗带的血块[9]。本实验结果显示，采用红景天苷处理后，脑出血大鼠血肿周围脑组织的VEGF表达明显高于未处理大鼠，推测红景天苷通过上调VEGF的表达，改善微血管与小静脉血管的通透性，促进微血管新生，从而保护脑出血损伤的脑组织。