苗床添加木霉菌肥对2种烟苗生长及抗逆酶活性的影响

曾庆宾，李 涛，苟小梅，余 伟，张宇羽，3，杨军伟，蔡 艳*，官 宇，闫芳芳

（1.四川农业大学资源学院，成都611130；2.四川省烟草公司攀枝花市公司，四川攀枝花617026；3.四川省绵竹市农业局，四川 德阳618200）

木霉菌（Trichoderma）是一种普遍存在的生防性真菌[1]，属于半知菌类丝孢纲丛梗孢目丛梗孢科[2]，它具有广谱性、生长繁殖速度快、适应性强等特点[3-4]，在防治植物病害方面具有较高的应用价值，已成为国际上最有学术和应用价值的资源微生物之一[5]。研究发现，木霉菌生防机制主要包括竞争、寄生、溶菌以及抗生等微生物间的拮抗作用[6]，却忽视了寄主植物本身的参与[7]，而木霉菌诱导植物系统抗病性较单一的生物拮抗机制更为重要，是对植物免疫能力的全面提升。除此之外，木霉菌还具有促进植物生长（提高土壤营养有效性和植物营养利用率）的作用[8]，主要表现在刺激种子萌发、根的伸长和开花结实[9]；此外，木霉菌肥能提高玉米的出苗率、根长、株高、鲜重和干重，对玉米生长具有促进作用[10]；木霉菌肥还能明显促进甜瓜、棉花等作物的生长[11-12]。

木霉菌肥在烤烟上应用已有大量研究，王革、陈志敏、陈小均等[13-15]研究发现木霉菌肥对烤烟黑胫病菌、疫霉菌、镰刀菌等具有拮抗作用，并对烤烟有一定的促生作用。烤烟一般适宜在pH值5.5～6.5的微酸性土壤中生长，但由于烤烟生产中长期大量施用硫酸钾和硝酸钾导致土壤pH值降低[16-17]，过低的pH值导致微生物活性受到抑制，土壤中直接施入木霉菌肥，无法得到良好的使用效果[18]。较土壤而言，育苗基质本身的环境较稳定且易于控制，有利于木霉菌肥发挥其作用。因此本文采用苗床添加木霉菌肥的方法，探究其对2种烤烟品种相关抗逆酶活性以及烟苗素质的影响，以期为木霉菌肥在烤烟上的应用提供理论依据和参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试植物：红花大金元（Honghuadajinyuan，抗性较弱）和云烟85（Yunyan85，抗性较强），其种子均由云南玉溪中烟种子有限公司提供。红花大金元对烟草常见病害抗性较弱，易感黑胫病、青枯病，中感野火病和烟草花叶病；云烟85具有优质、稳产、抗逆性强等特点，高抗黑胫病、青枯病，对烟草花叶病、根结线虫病抗性也较强[19]。

供试菌肥：木霉菌肥，由爱睦乐环保生物技术（南京）有限公司提供，每克菌肥含活菌数大于2亿，其全氮、全磷、全钾含量分别为0.08%、0.15%、0.22%。

供试土壤：水稻土，基本理化性质为：pH 5.95，有机质31.18 g/kg，全氮1.54 g/kg，全磷0.93 g/kg，全钾13.94 g/kg，碱解氮115 g/kg，有效磷24.08 g/kg，速效钾290.80 g/kg。

1.2 试验设计与处理

采用湿润育苗方法，在四川省攀枝花市米易县普威镇烤烟育苗大棚中进行育苗试验。育苗大棚内设有温度计和湿度计，调控温湿度在烟苗生长适宜范围内。依据木霉菌肥不同质量分数（菌肥/基质质量），2种烤烟各设4个处理：①T0（不施菌肥）；②T1（添加5%菌肥）；③T2（添加10%菌肥）；④T3（添加15%菌肥）。将菌肥与基质混匀后播种，每个苗盘装基质0.60 kg。苗盘含100穴，每穴1～2棵烤烟包衣种子，随机区组设计，3次重复。其他管理同常规。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 植株农艺性状测定

菌肥处理70 d（移栽前），从2种烤烟的每个处理各选取10株烟苗，测量其株高、茎围、最大叶长以及最大叶宽，并计算最大叶面积。

1.3.2 植株N、P、K含量测定

菌肥处理70 d（移栽前），从苗盘中随机选取30株烟苗，连同基质一起轻轻拔出，用自来水仔细冲洗根系和地上部，去除育苗基质及其他表面杂物，用去离子水洗净，吸水纸吸干水分，将根系与地上部分分开。随机选取10株于105℃杀青30 min，75℃下烘至恒重，分地上部分和地下部分分别称量。将烘干的根系和地上部分磨碎，过0.425 mm×0.425 mm筛子，浓H2SO4-H2O2消煮，凯式定氮法测定N含量，钒钼黄比色法测定P含量，火焰光度法测定K含量[20]。

1.3.3 抗逆酶活性测定

菌肥处理70 d（移栽前），根和叶分别取0.50 g鲜质量样品于液氮中研磨成粉末，分别采用愈创木酚法、紫外分光光度计法、抗坏血酸消耗量法测定烟叶和烤烟根系中过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性[21]。

1.4 数据处理

所有数据均用Microsoft Excel 2013整理与绘图，采用SPSS20.0软件进行数据方差分析和显著性分析。试验数据用"平均值±标准误"表示，采用最小显著差法（LSD）进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 木霉菌肥对2种烟苗生长的影响

由表1可知，除T1和T2处理的株高外，3个浓度的木霉菌肥均能显著提高2种烤烟幼苗株高、茎围、最大叶长、最大叶宽和最大叶面积。高浓度（T3处理）木霉菌肥对2种幼苗株高和茎围的促生作用最强，相比T0分别提高50.2%、33.9%和16.0%、16.7%；中低浓度（T1、T2处理）木霉菌肥对2种幼苗最大叶长的促生作用不及T3处理，T3处理叶片长度分别比T0高53.2%、16.9%，且与T0比差异显著；此外高浓度处理对红花大金元幼苗最大叶宽和最大叶面积提升显著，分别高出对照46.2%、123.0%；而云烟85的最大叶宽以T2处理最优，最大叶面积以T1处理最高。因此相比其他处理，高浓度T3处理对2种烤烟幼苗促生效果最佳。

表1 木霉菌肥对2种烟苗生长的影响Table 1 Effects of Trichoderma fertilizer on the agronomic characters of two tobacco seedlings

2.2 木霉菌肥对2种烟苗N、P、K积累量的影响

由表2分析可知，添加木霉菌肥后，红花大金元幼苗地上部分和地下部分N积累量均随着菌肥浓度的增加而呈现显著上升的趋势。其中以T3处理增加最多，地上部分和地下部分N积累量分别较T0提高93.0%和44.6%。随着木霉菌肥浓度的增加，红花大金元幼苗地上部分P积累量先降低后升高，而其地下部分各处理P积累量较T0均有显著提高，分别提高了17.9%、16.5%、37.8%。除T1处理地上部分外，其余处理地上地下部分红花大金元幼苗K积累量均显著高于T0处理。添加木霉菌菌肥后，除T1处理的地下部分K积累量外，云烟85幼苗的N、P、K积累量均显著高于T0处理，其中以T2、T3处理效果较好。

2.3 木霉菌肥对2种烟苗相关抗逆酶活性的影响

2.3.1 过氧化氢酶（CAT）

过氧化氢酶（CAT）普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力呈显著正相关关系[22]。由图1分析可知，苗床添加木霉菌肥均能不同程度提高2种烟苗CAT活性。就根部分而言，红花大金元CAT活性T2（1.44 U/mg）、T3（0.98 U/mg）处理较T0（0.50 U/mg）显著提高，其中T2处理较T0增加188.0%。云烟85 CAT活性以T1（1.70 U/mg）、T2（1.52 U/mg）处理提升效果显著，相比T0（0.86 U/mg）提高了97.7%和76.7%，而T3处理提升效果不显著。从叶部分来看，红花大金元CAT活性以T2（1.61 U/mg）处理效果最佳，较T0（1.28 U/mg）提高了25.8%。云烟85的CAT活性则随着木霉菌肥浓度的增加而呈持续升高的趋势，其中T2（1.45 U/mg）和T3（1.82 U/mg）提升效果显著，分别较T0（1.07 U/mg）增加36.4%和70.1%，由此可见，苗床添加木霉菌肥可显著提升2种烟苗CAT活性，其中添加10%菌肥的处理效果最明显，红花大金元提升效果优于云烟85，烟草根系比叶片更敏感。

2.3.2 过氧化物酶（POD）

过氧化物酶（POD）是植物体内普遍存在且活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系[22]。由图2可知，苗床添加中高浓度木霉菌肥可不同程度提高2种烟草幼苗根系POD活性，T3处理（3 563.9 U/mg、4 597.6 U/mg）分别较T0（3 143.9 U/mg、2 856.6 U/mg）处理显著增加13.3%和60.9%。从叶部分看，红花大金元T1（654.1 U/mg）、T2（668.2 U/mg）处理较T0（1 007.6 U/mg）POD活性分别降低35.1%和33.7%，但T3（1 208.9 U/mg）处理相比对照提高20.0%。此外，云烟85的POD活性虽随木霉菌肥浓度的增加先升高后降低，但均未达显著水平，说明木霉菌肥对云烟85叶POD活性无明显影响。综上所述，苗床添加中高浓度木霉菌肥可提高红花大金元和云烟85根系POD活性，高浓度木霉菌肥还可提高红花大金元叶POD活性。

表2 木霉菌肥对2种烟苗N、P、K积累量的影响Table 2 Effects of Trichoderma fertilizer on the N、P、K content of two tobacco seedlings

3 讨论与结论

由于木霉菌与植物根系相互作用的途径和生长素介导的信号传递途径相似，因此二者互作可以促进植物生长[23]，同时木霉菌剂的某些编码可以抑制植物激素乙烯合成，其含量减少同样可以促进植物生长[24]。本研究中，苗床添加木霉菌肥可以显著提高红花大金元和云烟85的株高、茎围、叶长叶宽等相关农艺性状指标；同时，喻会平、端永明、王革等[25-27]发现无论是使用木霉菌剂浸种或者喷施、直接施用木霉菌剂均能有效提高烟苗素质，为大田移栽提供可靠保障，这与本试验的研究结果一致。

近年来一些机构研究筛选出具有解磷解钾作用的木霉菌株，改菌株在应用时具有提高化肥利用率、大幅度降解农药、吸附重金属以及提高作物产量等作用[8]。本研究结果表明，育苗基质添加木霉菌肥可明显提高烤烟幼苗对N、P、K的吸收积累量，且随着浓度的增加呈持续上升的趋势，这是由于木霉菌肥提高了化肥和土壤养分的利用率[28]。王革等[27]认为烤烟施用木霉菌肥后，烟株的干物重、养分吸收量、肥料与土壤养分利用率均能不同程度提高，这与本试验的研究结果一致。

图1 木霉菌肥对2种烟苗过氧化氢酶活性的影响Figure 1 Effects of Trichoderma fertilizer on CAT activity of two tobacco seedlings

图2 木霉菌肥对2种烟苗过氧化物酶活性的影响Figure 2 Effects of Trichoderma fertilizer on POD activity of two tobacco seedlings

木霉菌生防作用机制主要包括：代谢多种胞外酶水解植物病原真菌细胞壁；代谢产生木霉菌素、绿木霉素、萜类、辛酮、氨基酸衍生物等抗生素类物质；产生植物防御反应的诱导因子，诱导植物抗性；以多种协同拮抗作用，抑制病原菌的生长与繁殖；增强植物组织的多种抗逆酶活性[29]。关于增强植物抗逆酶活性方面，庄敬华、黄艳青等[30-31]的研究发现，经木霉菌处理后黄瓜、甜瓜幼苗根系几种防御酶活性均有所上升，并且黄瓜和甜瓜幼苗枯萎病的发病率和病情指数在一定程度上控制得到。烤烟是依靠收获叶片而获得经济价值的作物，在其生长发育过程中易受到真菌、细菌性等多种有害生物危害[32]。而过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）则是生物演化过程中建立起来的生防生化系统关键酶，它们能使植物体内的活性氧及过氧化氢等物质转变为活性较低的物质，降低或消除它们对作物膜脂的攻击能力，使膜脂不被氧化而得到保护。抗逆酶活性的大小是表征植株抗逆性强弱的主要参数，因此可以反映菌剂添加后诱导烟苗抗性的作用效果[29，33]。本试验结果表明，木霉菌肥可以有效提高红花大金元和云烟85烟苗根系和叶片的CAT和POD活性，增强其对烟草病害的抗性，尤其是对易感病的红花大金元品种的抗性强化作用更加明显，10%添加量时其根系CAT活性较对照增加188.0%，而云烟85仅增加了76.7%。本试验还表明，2种烟草根系抗逆酶活性增加率普遍高于叶片，说明木霉菌肥可能对增强2种烟草抵抗土传病害（如黑胫病、青枯病）的作用效果优于空气传播病害（如花叶病）。

苗床添加木霉菌肥对红花大金元和云烟85幼苗的生长和养分吸收均表现出明显的促进作用，其株高、茎围、最大叶面积等生长指标和N、P、K积累量均显著增加，中高浓度添加量烟苗促生效果和养分吸收增加量更明显。此外，苗床添加木霉菌肥均能不同程度提高2种烟苗根和叶的过氧化氢酶、过氧化物酶活性，红花大金元提升作用强于云烟85，根系增加幅度高于叶片，过氧化氢酶和过氧化物酶活性分别在10%和15%浓度达到最高或次高值。