牦牛MDHI基因的克隆及组织表达分析

陈露露 王会 柴志欣 钟金城 王吉坤 陈智华 姬秋梅信金伟

（1. 西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，成都 610041；2. 西南民族大学 青藏高原研究院，成都 610041；3. 西藏自治区农牧科学院省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，拉萨 850009）

牦牛（Bos grunniens）是偶蹄目、牛科、牛亚科动物，牛属中的一个独立物种，体型庞大，肺脏发达，气管较短，是青藏高原特有的大型反刍动物，享有“高原之舟”美誉，是游牧民生活所依赖的重要生产资料。目前，全世界的家牦牛约 1 400万头，野牦牛约15 000 头（具体数量会不断上升），其中在中国的数量和品种是全世界最多的［1-2］。牦牛长时间生活在海拔2 000 m-5 000 m的高寒地带造就了它耐低温低氧的特性。因为汗腺不发达，所以不宜生活在海拔相对较低，环境温度相对较高的地区。牦牛肉及奶具有很高的营养价值，其肉中蛋白含量高出黄牛的1/3，乳脂率是奶牛的两倍［3］。

苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase，MDH）基因属于同工酶家族，在氧化还原反应的催化过程中发挥着重要功能。在高等生物中分为细胞质苹果酸脱氢酶（Cytoplasmic malate dehydrogenase，MDHI）和线粒体苹果酸脱氢酶（Mitochondrial malate dehydrogenase，MDHII），它们均是 2个相同亚基组成的同源二聚体，是NAD＋依赖性脱氢酶，每个亚基都有相应的催化功能，是三羧酸循环中重要的氧化还原酶，在动物体各个组织中广泛表达，控制着动物体的能量代谢。近年来，关于MDH基因参与机体调节的研究有很多，如蜜蜂的MDH基因分MDHI、MDHII和MDHIII三个区带［4-6］；鸡的MDH基因5'侧翼区235 bp处有一个SNP位点，可作为影响鸡的生长性状的主效基因［7］；张沅等［8］认为猪背膘外层脂肪中MDH活性会影响肉用性状的选育。前人对该基因在牦牛上的研究结果表明：牦牛心肌MDH/LDH活力比显著高于水牛和黄牛，但在不同牛种骨骼肌之间无显著差异，这说明尽管牦牛生活在高海拔的缺氧环境中，但心肌仍以有氧代谢占明显优势，牦牛心肌组织中高的MDH/LDH活力比反映了其正常的有氧能量代谢状况［9］。本研究首次对牦牛MDHI基因进行克隆，结合生物信息学分析和组织表达分析，旨为进一步研究该基因的遗传特性、生理机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

于西藏自治区昌都市类乌齐县，选取4.5岁健康的类乌齐牦牛3头，分别采集心脏、肝脏、肺脏、臀肌和臀脂，DEPC冲洗，锡箔纸包装迅速置于液氮保存备用。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及反转录 Trizol法提取RNA，使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶检测RNA的浓度和纯度，于-80℃保存备用。根据反转录试剂盒（TaKaRa公司）说明书，对总RNA进行反转录合成cDNA，标记后于-20℃保存。

1.2.2 引物设计及PCR扩增 根据GenBank中公布的预测野牦牛MDHImRNA序列（XM005901271.2）， 利 用 Primer Premier5.0 设计引物扩增牦牛MDHI基因CDS区，引物序列为 F：5'-GAGTCGGTTCCACGATAGAGG-3'，R：5'-CTTTGGGGCATTTAGTAACATC-3'，由英潍捷基（上海）生物科技有限公司合成。

PCR 反 应 体 系 为 25 μL。 其 中 ddH2O 9.5 μL，上下游引物各为 1 μL（10 pmol/μL），cDNA 模版为1 μL（200-600 ng/μL），Taq Green PCR Master Mix 12.50 μL（0.625 U）。PCR扩增条件：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，55.2℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，33次循环，72℃终延伸5 min，4℃保存。

1.2.3 目的基因测序 将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用DNA纯化试剂盒（TianGen公司）进行纯化胶回收，连接到pMD19-T载体（TaKaRa公司）上，16℃过夜连接后转化到DH5α感受态细胞（大肠杆菌）中，涂于含有Amp+的LB固体培养基上，37℃培养10-12 h。筛选出阳性克隆在7 mL含Amp+的LB液体培养基中，37℃震荡培养10-12 h，对菌液进行PCR鉴定后（PCR体系与扩增体系相同），利用质粒提取盒（TianGen公司）提取质粒并送至英潍捷基（上海）生物科技有限公司进行测序鉴定。

1.2.4 组织表达分析 根据克隆得到的目的片段设计实时荧光定量特异性引物，序列为F：5'-ATTCTCGTGCTGTTGGA-3'，R ：5'-TCTTTGAAGGCAATCTCC-3'。内参（GADPH）引物为F：5'-CCACGAGAAGTATAACAACACC-3'，R ：5'-GTCATAAGTCCCTCCACGAT-3'。

反应体系 10 μL ：5 μL SYBR premix Dimer Eraser（2×），上下引物各 0.4 μL，无菌去离子水 3.2 μL，cDNA（稀释 2-3 倍）1.0 μL。

定量程序：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，39个循环。

采用2-△△CT法计算目的基因表达量，GAPDH作为内参基因对样本定量结果进行处理，结果表示为平均值±标准误（±s）。选择One-way ANOVA和t-检验进行显著性分析。

1.2.5 生物信息学在线分析 牦牛MDHI基因克隆序列进行生物信息学分析，所用软件如表1所示。

表1 在线软件网址

2 结果

2.1 牦牛MDHI基因克隆

PCR产物由1%琼脂糖凝胶电泳分析得到条带单一、大小与目的条带相符合的片段，如图1测序结果表明克隆到的MDHI基因DNA序列长为1 169 bp。

图1 牦牛MDHI基因PCR扩增产物

利用NCBI的 ORF Finder 在线程序对克隆得到的牦牛MDHI基因序列进行开放性阅读框分析，得到MDHI基因CDS区序列长为1 005 bp，编码334 个氨基酸，起始密码为ATG，终止密码为TGA（图 2）。

2.2 MDHI蛋白的理化性质预测

MDHI基因氨基酸序列理化性质分析结果表明：氨基酸总数为334，其中Leu、Ala和Lys含量最多，分别为9.6%、9.3%和9.3%，不含Pyl和Sec，带负电的残基总数（Asp + Glu）为43，带正电的残基总数（Arg + Lys）为41，分子式为 C1628H2628N428O487S14，分子量为 36 438.19，理论等电点为6.61，亲水性平均值（GRAVY）：-0.033，脂肪指数为98.98，半衰期为30 h，不稳定指数为19.93，为稳定蛋白。

2.3 牦牛MDHI蛋白的亲水性/疏水性预测与分析

利用位于 Expasy 的 ProtScale 在线软件进行疏水性/亲水性分析，Window size设置为9（图3）。通过对图3的分析可以得到：ASIP在40位处有最大值2.767，在96位处有最小值-2.933，MDHI蛋白表现为亲水性。

2.4 牦牛MDHI基因编码蛋白跨膜区与信号肽分析

利用软件SignalP 4.1在线分析蛋白质的信号肽，发现无信号肽，说明MDHI不是分泌蛋白，如图4。MDHI基因编码蛋白跨膜区如图4所示，由图可知，o-＞ i（膜外跨到膜内）有两个区域，分别是6-22位和34-54位，i-＞o（膜内跨到膜外）有两个区域，分别是7-25位和35-55位，其中从7位-25位为拓扑结构，分数为1 221（大于500）。

图2 牦牛MDHI基因编码的蛋白序列

图3 牦牛MDHI基因的亲水性/疏水性区分析

2.5 牦牛MDHI基因编码蛋白结构域与蛋白功能位点预测

使用Interpro在线软件预测MDHI基因编码蛋白结构域，发现该蛋白属于保守蛋白结构域家族。3-328位氨基酸具有MDH蛋白结构域活性，是柠檬酸循环中的关键酶之一，促进苹果酸转化为草酰乙酸，并通过丙酮酸的还原羧化来补充草酰乙酸水平，该亚族的成员是定位于细胞质和胞质溶胶的真核MDHs，如图5。

利用NetPhos2.0预测其磷酸化位点，在牦牛MDHI基因编码的氨基酸中共发现有11个Ser磷酸化位点、11个Thr磷酸化位点、4个Tyr磷酸化位点，如图5。

2.6 牦牛MDHI基因编码蛋白的高级结构预测

图4 牦牛MDHI编码蛋白的信号肽（A）和跨膜区（B）分析

蛋白质的理化性质和各功能取决于其空间结构，利用SOPMA对MDHI蛋白二级结构进行预测，得到该蛋白主要以α-螺旋，无规卷曲为主，其中：α-螺旋有152个，占总链的45.51%；无规卷曲有110个，占总链的32.93%；延伸链有58个，占总链的17.37%；β-转角有14个，占总链的4.19%（图6）。利用SWISS-MODEL预测软件分析发现该模型与猪细胞质苹果酸脱氢酶，α-酮丙二酸和四氢NAD的三元复合物的晶体结构具有98.50%的相似性，三级结构预测与二级结构预测结果一致（图6）。

2.7 亚细胞定位

利用PSORT II Prediction软件分析牦牛MDHI蛋白亚细胞定位：该蛋白在内质网的分布最多，为33.3%；在高尔基体和细胞核内分布最少，分别为11.1%，细胞质和线粒体分别为22.2%。

2.8 同源性、系统进化树分析

利用DNAstar软件对牦牛MDHI基因与其他物种进行多序列同源比较。由表2可知，牦牛MDHI基因在核苷酸水平上及进化过程中表现较为保守。其中，牦牛MDHI基因与黑猩猩（NM_001243069.1）、家猫（NM_001009329.1）、猕猴（NM_001320104.1）、普通牛（NM_001034628.3）、人（NM_005917.3） 和 野 猪（NM_213874.1） 的同源性较高，分别是93.5%、94.4%、93.1%、99.2%、93.1%和94.6%，普通牛最高；其次是原鸡（NM_001006395.2）和小家鼠（NM_001316675.1），同源性为80.8%和87.6%；同源性较低的是非洲爪蛙（NM_001006693.2）、 果 蝇（NM_001298874.1）和青鱂（NM_001163134.2），同源性分别为78.8%、62.8%和71.2%，其中果蝇同源性最低。

图5 牦牛MDHI结构域预测（A）及磷酸化位点（B）分析

图6 牦牛MDHI基因编码蛋白的二级（A）和三级（B）结构预测分析

表2 牦牛与11个物种MDHI基因的序列同源性比对

利用MEGA5.2对牦牛MDHI基因和其他不同物种进行系统进化树分析，发现牦牛和普通牛的亲缘性最近；其次为野猪和家猫，与青鱂亲缘性最远；其中牦牛、普通牛、野猪、家猫、猕猴、黑猩猩和人形成一个分支，而小家鼠、原鸡、非洲爪蛙、果蝇和青鱂形成其他分支，如图7。

2.9 组织表达分析

图7 牦牛MDHI基因核苷酸序列系统进化树分析

结果（图8）表明：MDHI基因在牦牛臀脂和肺脏组织中表达水平最高，在肝脏中最低，在臀脂中的表达水平显著高于其他组织（P＜0.05），肺脏组织中的表达水平也显著高于臀肌、心脏和肝脏（P＜0.05）。

图8 牦牛MDHI基因的mRNA组织表达分析

3 讨论

青藏高原地域广阔，物种多样性丰富，具有宝贵的畜种资源和基因库，牦牛遗传资源丰富。中国牦牛遗传资源是世界上最多的，关于牦牛的研究也很多，如低氧适应性、肉质性状相关性、生殖性状相关性等一系列研究。

MDH具有氧化还原酶活性，作用于供体的CH-OH基团，其中NAD或NADP作为受体，CH-OH基团充当氢或电子供体用于减少NAD 或NADP氧化还原反应的催化活性；具有苹果酸脱氢酶活性，能够催化丙酮酸或草酰乙酸向苹果酸发生可逆转化，并在生理温度下对生物化学反应进行催化，是TCA（三羧酸）循环和乙醛酸循环的组成部分，重要的代谢中间体，控制着动物体呼吸代谢等一系列生命活动。近年来，关于MDH基因能抑制癌细胞代谢，也可以作为肿瘤中的潜在治疗靶标［10-12］。GhcMDHI可能参与棉花纤维快速伸长过程，6-苄基腺嘌呤处理对葡萄果实中MDH基因的表达表现为抑制［13-14］。不同浓度的丁香酚可降低金黄色葡萄球菌MDH酶活性，戈壁异常球菌能够有效保护 MDH酶活性［15-16］。但该基因在牛羊等家畜上的研究较少，为补充牦牛基因库，因此克隆了MDHI基因，并对其进行了相关生物信息学分析。

本研究成功克隆了牦牛MDHI基因，为进一步研究牦牛MDHI基因提供了理论参考。该基因序列全长为1 159 bp，CDS序列长1 056 bp，编码334个氨基酸，属于亲水性序列，编码的蛋白质没有信号肽，不属于分泌蛋白和结构蛋白。该蛋白带负电的残基总数（Asp + Glu 为43）大于带正电的残基总数（Arg + Lys 为41），故该蛋白带负电。MDHI基因编码的蛋白质包含26 个磷酸位点，为以后蛋白磷酸化研究提供了帮助，具有两个跨膜区，说明该基因有帮助膜蛋白附着在膜上的功能和信号传导功能，其他功能还有待研究。同时该蛋白有1 个保守功能结构域，为NADB Rossmann superfamily结构域，通过Rossmann折叠与NADPH结合。在糖酵解等许多代谢途径的脱氢酶中均发现这种结构域，说明该蛋白可能参与动物体内的糖代谢途径。对同源性预测结果显示与系统进化树结果基本一致，表明牦牛MDHI基因在长期的进化发育过程中保持高度保守性。高级结构预测该蛋白二级结构和三级结构主要以无规卷曲和-螺旋为基础进一步在空间上延伸，其中-螺旋高达45.51%，作为一种混合类蛋白，推测这种结构影响该蛋白在糖酵解或氧化还原等过程中的信息传递。另外，亚细胞定位发现MDHI蛋白在内质网、高尔基体和线粒体上的表达最高，分别为33.3%、22.2%和22.2%。内质网是真核细胞中重要细胞器，参与糖类、脂类合成，蛋白合成及折叠与分泌，主要的合成蛋白为跨膜蛋白和分泌蛋白，而MDHI为跨膜蛋白；线粒体是机体的“能量工厂”，是细胞有氧呼吸的重要场所，因此推测MDHI基因编码的蛋白质参与了细胞有氧呼吸；细胞质是细胞质膜以内，细胞核以外的部分，由胞质溶胶和细胞器组成，大部分物质的中间代谢和一些蛋白修饰都是在胞质溶胶中进行。因此，该蛋白可能参与糖酵解等代谢途径。

MDH的活性影响着动物体的代谢及生长。有研究发现，MDH在血清中的活性在不同性别的猪中有差异，雄性体内MDH活性随着年龄的增长而增长，而雌性则不然［17］，由此推测，牦牛MDHI基因是否也有此差异，有待下一步实验验证。NADPH是动物体内重要的脂肪合成辅酶，而MDH能够催化动物体内苹果酸转变为丙酮酸并产生NADPH，因此MDH在脂肪合成中起到重要作用［18］。同时，MDH基因编码的氧化还原酶在机体内部调节及肌肉和脂肪组织的能量代谢中发挥重要功能［19］，这一观点在猪［20-21］和鸡［22］中得到证实。在本研究中的荧光定量分析可知，MDHI基因在臀脂的表达量最高，推测该基因能够控制牦牛的脂肪合成及能量代谢。同时，肉质柔韧性和肌肉内脂肪含量是牛肉感官品质的关键属性，脂肪形成分化可以通过MDH1的乙酰化来调节，并且MDH1的乙酰化是脂肪生成和细胞内能量水平之间的串扰机制之一［23-24］，如果进一步探究该基因在牦牛脂肪沉积方面的功能，将促进优质牦牛品种的培育。牦牛主要生活在高海拔氧含量低的高寒地区，肺脏作为机体呼吸的重要器官之一，为适应高原极端气候条件而发生显著改变，本研究表明，牦牛MDHI基因在肺脏中具有较高的表达水平，可推测该基因可与牦牛低氧适应性具有调控作用，就此可作进一步研究。

4 结论

本研究克隆了牦牛MDHI基因，并进行序列分析，得到该基因CDS区全长1 005 bp，编码334个氨基酸，编码的蛋白为亲水性稳定蛋白，在进化水平上较为保守；对不同组织表达进行分析得到MDHI在臀脂中表达量最高，在臀肌中表达量较低，说明该基因参与机体脂肪沉积调控。