水通道蛋白与先天性白内障研究进展

赵靖康，刘 旭，何 媛

作者单位:1(710016)中国陕西省西安市，西安医学院;2(710038)中国陕西省西安市，西安医学院第二附属医院眼科

0 引言

先天性白内障(congenital cataract)是一种较常见的儿童眼病，是造成儿童失明和弱视的主要原因。先天性白内障是指出生前即存在或出生后才逐渐形成的先天性遗传或发育障碍的白内障［1］。遗传性先天性白内障有三种不同的遗传方式:常染色体显性遗传(AD)、常染色体隐性遗传(AR)和性连锁先天性白内障。遗传性先天性白内障以常染色体显性先天性白内障(autosomal dominant congenital cataract，ADCC)最多见。将近三分之一的先天性白内障可能有相关的基因突变。随着分子遗传学的发展，越来越多的晶状体蛋白基因，膜蛋白基因，骨架蛋白基因和调控蛋白基因等已经被证实参与了先天性白内障的发病过程［2］。而水通道蛋白在调节晶状体水代谢，维持晶状体内部微循环稳态、参与晶状体生理功能和透明性方面起着重要作用。晶状体中主要含有 AQP0、AQP1、AQP5以及AQP7，近年来，研究人员报道了AQP1(MIP)相关基因突变通过各种不同的机制引起的人类家系和啮齿动物的先天性白内障，但关于AQP1、AQP5以及AQP7相关基因突变引起的先天性白内障尚未在人类白内障家系中报道过。本文介绍了晶状体水通道蛋白的亚型在人体晶状体上的区域差异性分布，总结了近年来人类和动物水通道蛋白基因突变引起晶状体混浊的机制。

1 正常晶状体的结构

正常成人的晶状体呈一个无血管供应的扁圆球体，位于房水和玻璃体之间。晶状体由位于前极的单层上皮细胞和填充晶状体大部分的纤维细胞组成。在赤道周围的狭窄区域，上皮细胞分化为纤维细胞，新的纤维细胞不断地被添加到晶状体的外皮层，分化程度高的纤维细胞位于晶状体核，而新分化的纤维细胞位于晶状体的外周［3－4］。

晶状体纤维细胞靠无氧酵解获得能量，以前认为水通过自由扩散的方式穿透脂质双分子层，然而脂质双分子层的特性不足以解释如此大量的水转运，所以一定存在一种比被动扩散更有效地将营养物质输送到晶状体并把废物从更深层的细胞层移出的通道。近年来，水通道蛋白(aquaporins，AQPs)已经成为广泛研究的焦点。

2 AQPs在体内的分布

目前在哺乳动物中已鉴定出13种水通道蛋白(AQP0～12)。Tran等［5］将两只人眼球组织等分后，用RT－PCR方法分别检测角膜、角膜缘、睫状体等组织。发现AQP7、AQP9和AQP11在睫状体、角膜缘组织、视神经、视网膜以及巩膜均有mRNA转录。脉络膜中检测到AQP9和AQP11 mRNA。在角膜上皮、角膜内皮、小梁网内皮等中检测到了抗AQP7免疫标记。在无色素沉着的睫状上皮和视网膜神经节细胞中检测到AQP9免疫标记。角膜缘上皮和内界膜中检测到了AQP11免疫标记。AQP7定位于脂肪组织、心脏和横纹肌的毛细血管中，可能与甘油代谢有关。最近，Ishibashi等［6］通过免疫组化在人晶状体中同样检测到AQP7。Skowronski等［7］研究表明AQP7可以调节脂肪组织中的毛细血管细胞、心肌细胞和横纹肌细胞的能量代谢，推测AQP7在晶状体中发挥相似作用。眼球里没有检测到AQP6、AQP8、AQP10或AQP12的mRNA。

晶状体上皮细胞有AQP1表达，起水通道的作用［8］，晶状体纤维细胞大量表达AQP0［9］。两者共同调节晶状体水代谢，维持晶状体生理功能及透明性。AQP0最初称之为主体内在蛋白(major intrinsic protein，MIP)，后来被证实属于水通道蛋白家族。以前认为只在晶状体纤维细胞中表达，AQP0现已有报道在视网膜、肝脏和睾丸中表达。AQP0是晶状体纤维细胞膜中最丰富的水通道蛋白，虽然含量丰富，但为弱水通道，AQP0的水通透性较AQP1明显更小，比AQP1低30倍，比AQP5低约20倍［10］。在AQP0中间含有Tyr24，这种异常窄的导水通道打破了单场水分子的氢键模式。在其他哺乳动物AQPs中没有发现这种结构，这可能是AQP0比其他水特异性AQP(如AQP1)传导水的速度慢的原因。AQP1狭口直径约2.8A，恰好是一个水分子的大小。水通道蛋白通过通道的空间大小，特异的溶质结合位置及有限的亲水环境限制了包括质子在内的小分子通过，而只允许水分子快速通过［8］。非洲爪蟾卵母细胞是一种低透水性的细胞。AQP1在非洲爪蟾卵母细胞中的表达导致该细胞水渗透性增加约40倍。AQP0的水通透性较低，且具有pH值依赖性，在弱酸环境中AQP0的水通透性可大幅增加［11］，其水渗透性也可以通过Ca2+的变化来调节。AQP0具有细胞间粘附能力，而AQP1不具有细胞粘附能力［12］。此外，AQP0还与晶状体蛋白及γ晶状体蛋白有交互作用［13］。AQP5也存在于纤维细胞中，但数量较少，估计为晶状体AQP0水平的5%［14］。

3 AQPs的结构和功能

AQPs是28～30kD的主要内在蛋白质(MIP)的超家族，在原核生物和真核生物中都有表达，分子结构有共同特点，相对分子量为30kD所有的水通道蛋白均形成四聚体，每个单体在功能上作为独立的水通道参与水代谢的调节。有学者将其分类为水通道蛋白(aquaporins)包括AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6，水－甘油跨膜蛋白通道 (aquaglyceroporins) 包括 (AQP3、AQP7、AQP8、AQP9、AQP10)和超水通道蛋白(superaquaporins)包括AQP11、AQP12。水通道蛋白具有6个跨膜结构域(H1－H6)，3 个胞外环(LA、LC、LE)，2个胞内环(LB、LD)以及N端和C端的2个跨膜结构域［8］哺乳动物中，已经鉴定出13种AQPs(AQP 0～12)。通过序列对比证实AQP0与AQP1非常相似［15］。AQP1在细胞膜中以四聚体形式存在，每个单体是一个独立的功能单元，中心存在一个通道，形成跨膜沙漏样结构［16］。AQP1单体由6个斜向跨膜α螺旋构成基本骨架，AQP1的亚基中含有两个含Asn－Pro－Ala(NPA)的环位于脂质双层的内外表面上。六个跨膜的α螺旋围绕着两个含NPA的含水孔。在两个短α螺旋末端的所有水通道蛋白中都存在一个ASN－Pro－Ala－NPA－氨基酸序列，通道的最窄部分由4个氨基酸残基组成:Hisl80、Ar9195、Phe 56 和 Cysl89［17］。

4 AQPs的调控

哺乳动物AQPs最常见的调节机制是转运，在维持晶状体透明度方面发挥着重要作用。AQPs分子在细胞内储存位点与质膜之间穿梭控制AQPs膜的数量，可以控制膜的水通透性。已经鉴定出的13种哺乳动物中的大多数AQPs是根据激素或环境因素而通过转运来调节的，例如pH值、钙/钙调蛋白［18］、磷酸化、抗利尿激素等。

5 AQPs基因突变导致人类先天性白内障

由于AQP0、AQP1和AQP5有着不同的水分渗透性和调节机制［3］迄今为止研究的所有哺乳动物晶体中这三种AQPs区域表达的保守性意味着这三种水通道蛋白对晶状体稳态有着重要的作用。

5.1 AQP0突变 由于AQP0(MIP)在晶状体中含量最为丰富，其基因突变引起的后果最为严重。编码AQP0基因的任何突变均可能引起蛋白质折叠的显著改变，破坏AQP0的转运机制和水通道功能，从而导致先天性白内障。例如，Francis等［13］确定了一个先天性进行性晶状体片状混浊的家族。测序显示该基因突变位点位于12q14，MIP基因的错义突变是发生白内障的基础。Wang等［19］在一个中国家系中发现了MIP第二个胞外环区域突变导致先天性白内障。基因测序检测到主要内在蛋白(MIP)编码区中的杂合c.319G＞A变异，导致异亮氨酸取代高度保守的缬氨酸(p.V107I)。

5.2 AQPs突变引起晶状体混浊的机制

5.2.1 突变影响细胞间粘附性 AQP0在晶状体纤维细胞中具有双重功能，除对水有渗透性功能外，一些研究表明AQP0还是晶状体细胞间的黏附分子［20］。AQP0相邻分子间的连接与缝隙连接不同，它们构成的间隙比缝隙连接窄，为11～13nm，这种连接的形成可导致水通道关闭。AQP1替代基因敲除小鼠中的AQP0不能完全消除白内障表型，表明AQP0中存在基本的细胞间粘附特性，而AQP1不存在这种特性。

Kumari等［14］通过检测发现在一个中国常染色体显性先天性白内障家系中，错义突变导致第33位氨基酸(R33C)处的精氨酸变为半胱氨酸。通过定点诱变在野生型(WT－AQP0)人类AQP0 cDNA中重新产生了该突变，并在异源表达系统中克隆并表达了突变体AQP0(AQP0－R33C)。突变体AQP0－R33C显示出与WT－AQP0相同的膜蛋白运输和定位。在爪蟾卵母细胞中进行的功能研究显示AQP0－R33C和WT－AQP0之间的水渗透性没有显著差异。细胞间粘附测定表明，与WT－AQP0相比，AQP0－R33C的细胞间粘附性显著降低。该研究预测了AQP0中细胞外环A(LA)的保守正电荷在细胞粘附中发挥重要作用。

5.2.2 突变导致AQP0转运机制破坏 AQP0在内质网合成后，需要转运至细胞膜上才能发挥水通道作用。任何影响其转运的因素均可导致水通道蛋白的减少，从而导致白内障。经典的先天性白内障CatFr小鼠中，AQP0基因一个剪接位点突变，从而在亚细胞结构中累积 AQP0(AQP0－LTR)，导致白内障和晶状体囊袋皱缩。在其他AQP0突变小鼠模型包括Lop、Cat Tohm和Hfi小鼠中，每一种突变型AQP0蛋白质都未能转运至纤维细胞膜，从而导致双眼白内障。

在人类中，已经检测到几种AQP0突变导致AQP0向纤维细胞的转运失败从而产生白内障。这些突变包括Glu134Gly、Thr138Arg 、Arg233Lys、Arg33Cys、Asp150His 以及C－末端截短突变体Δ213－AQP0和Tyr219stop。

Kumar等［21］在一个印度先天性白内障家系中鉴定出MIP(c.494G＞A)的一个新突变，该突变导致AQP0中的天冬氨酸(G165D)替换高度保守的甘氨酸。不同于野生型AQP0、AQP0 G165D在爪蟾卵母细胞中的表达不利于低渗培养基中的溶胀。在转染HeLa细胞中，野生型AQP0主要定位于质膜，而AQP－G165D主要定位于内质网。这些结果表明，这种保守的甘氨酸残基的突变导致AQP0－G165D的不当运输和水通道功能的丧失。

Shentu等［22］对一个中国家系先天性进行性皮质点状白内障的四代的遗传和功能缺陷进行研究发现，MIP第448位(c.448G＞C)存在错义突变，导致保守的天冬氨酸在密码子 150(p.D150H)处被组氨酸取代。野生型和p.D150H突变型AQP0分别在HeLa细胞中表达，免疫荧光结果显示WT－AQP0分布在质膜和细胞质中，而AQP0－D150H未能到达质膜，主要保留在高尔基体中。

5.2.3 突变影响AQPs与钙调素的结合 R233K不影响AQP0在质膜上的定位，但减少与钙调素(一种调节性钙结合蛋白)的结合［14］。Fields等［23］研究表明 AQP0 对外部钙浓度增加而降低其渗透水的渗透常数(Pf)，通过与钙结合信使蛋白、钙调素(CaM)和钙结合位点的磷酸化相互作用而介导消除钙敏感性。AQP0磷酸化通过改变AQP0－CaM相互作用界面来改变钙敏感性，特别是在连接第四和第五跨膜螺旋的富含精氨酸的环上。这个环位于AQP0细胞质表面典型钙调素结合位点的外面，机械性的将钙调素结合到第二个收缩位点的孔洞门控残基上。这个变构环对于通道的CaM调节，促进相邻亚基之间的合作和调节因素，如丝氨酸磷酸化是至关重要的。类似的变构相互作用也可介导CaM调制其他CaM调节蛋白的性质。此外，AQP5的转运被报道通过Ser156和Thr259的PKA磷酸化来调控。Watanabe等［24］在KFRS大鼠中发现了一种新的白内障突变。在出生后1mo内，所有KFRS4/KFRS4纯合子均发生白内障，晶状体核具有严重的混浊。在KFRS4/+杂合子中没有观察到晶体混浊，继续观察这些大鼠，直到它们达到1岁，发现kfrs4/+大鼠没有发生白内障。识别突变定位后发现，在7号染色体上，该突变被映射到约97.Mb的区域，其中包含MIP基因。突变衍生的MIP基因的序列分析鉴定出5bp插入。这种插入被预测为使MIP蛋白失活，因为它产生移码突变，导致合成6个新的氨基酸残基，kfrs4/+杂合子在晶状体中Mip mRNA和MIP蛋白表达降低，kfrs4/kfrs4纯合子在晶状体中无表达。这些结果表明，kfrs4突变通过mRNA衰变机制使Mip mRNA降解，导致功能失活。因此，KFRS4大鼠是MIP基因中隐性突变的第一个特征性大鼠模型。

6 AQP1

AQP1是第一个被发现的存在于红细胞上的分子水通道。Preston等［25］因为发现了AQP1的家族的第一个成员得到了2003届诺贝尔化学奖的认可。AQP1是一种普遍存在的组成型水通道。人和啮齿类动物晶状体在上皮细胞的顶端和基底外侧膜有表达。

AQP1缺失小鼠的研究表明AQP1对晶状体上皮细胞水转运的重要性［26］。这些AQP1缺陷的晶状体具有正常的形态，但上皮细胞对水的渗透性较低，这表现在基础含水量较高，在低渗溶液中培养后反应较小，在细胞溶胀试验中平衡较慢。AQP1在野生型小鼠晶状体前极上皮细胞中表达，AQP1阴性小鼠无AQP1表达。AQP1在小鼠中的缺失或突变并没有改变晶状体形态或透明性。但AQP1空白小鼠的基础含水量显著高于对照组。类似的实验也表明了晶状体上皮细胞中AQP1的缺失导致AQP1基因敲除小鼠晶状体水通透性下降约3倍［14］。同样的研究报道了在高糖溶液中培养的AQP1敲除的晶状体用对乙酰氨基酚处理后用于诱导白内障，与对应野生型未处理晶状体相比，加速晶状体混浊的发展。结论是在正常条件下，小鼠AQP1基因敲除和突变以及人的AQP1基因突变不会导致白内障。然而，Ruiz－Ederra等［27］发现 AQP1缺乏在应激条件下在小鼠晶状体内和体外诱发白内障。然而，在人的AQP1突变在压力的条件下晶状体发展为白内障方面的文献还未见报道。此外，最近研究表明，白内障患者晶状体上皮细胞中AQP1的膜表达水平增加［28］。因此，AQP1促进晶状体透明度的维持，对抗白内障的形成，提示AQP1诱导延缓白内障发生的可能性。

7 AQP5

一直以来，人们认为晶体纤维细胞中只表达的两种水通道蛋白，AQP0和 AQP1。然而，直到 Patil等［29］在大鼠晶状体中检测到AQP5 mRNA，Wistow等［30］在成年人晶状体的表达序列标签分析中发现AQP5转录物，才证实了全长AQP5蛋白存在于整个晶状体中，并且晶状体深部区域的AQP5含量明显减少。Bassnett等［26］利用蛋白质组学方法研究了牛和鼠的晶状体，在晶状体纤维细胞膜细胞蛋白水平上也检测到AQP5。这些结果被Kumari等［14］用共聚焦显微镜所证实.

Grey等［28］实了小鼠、大鼠、牛和人的晶状体中AQP5的表达，表明晶状体纤维细胞膜上含有另外一条水通道，AQP5序列很大程度上在物种中是保守的，并且与AQP0中的等同序列有明显的差异。将小鼠、大鼠、牛和人的晶状体分为外皮质，内皮质和核，并分别用Western blots检测AQP5蛋白后发现，在小鼠中，免疫反应性存在于皮质中并且在核中减少。在大鼠中，内部皮层的免疫反应性大大减弱并且在核中消失。而在所研究的牛和人的晶体中观察到AQP5的免疫反应性，但在晶体核中降低。有趣的是，人类晶状体外皮层中出现了明显的AQP5双峰。由此可见，AQP5在多种物种的晶体中表达，并且显示AQP5的表达随纤维细胞分化而变化。结果显示AQP5是晶体纤维细胞膜的重要组分，代表这些细胞中丰富程度仅次于AQP0的水通道。蛋白质组学结果估计AQP5的丰度大约是人类晶状体中AQP0的5%。与AQP0相比，AQP5具有更高的透水性［14］。

AQP5研究的更好的动物模型是小鼠，其中AQP5的水平似乎高于大鼠。AQP5裸小鼠没有晶状体混浊的迹象，Kumari等［31］使用野生型(WT)和 AQP5 敲除(AQP5－KO)小鼠的晶体进行研究。发现AQP5蛋白在角膜和晶状体中的表达，而且仅在角膜上皮细胞层发现AQP5的表达和定位，中央角膜中前弹力层的角膜细胞中以低水平表达，而在角膜和角膜缘结合处角膜细胞中以高水平表达。免疫荧光染色验证野生型(WT)晶体中的AQP5表达，AQP5敲除(AQP5－KO)小鼠中缺乏表达。体内和体外培养结果均显示，AQP5敲除型晶体在形态和透明度上与野生型相似。AQP5通过在高血糖应激条件下调节由葡萄糖转运蛋白和共转运蛋白引起的渗透性肿胀来维持晶状体透明度和稳态。AQP5基因组DNA序列具有3个内含子和4个外显子。AQP5敲除(AQP5－KO)小鼠显示角膜上皮细胞膜的水渗透性减少，角膜厚度明显增加［24］。当角膜上皮细胞处于低渗状态时，相比于野生型(WT)小鼠，(AQP5－KO)小鼠肿胀后的恢复率降低。

AQP5在晶状体微循环中发挥关键作用，以维持透明度和稳态，尤其是在压力条件下提供保护。研究人员用105个白内障晶状体和来自屈光手术治疗个体的26个晶状体作为对照，分析人晶状体上皮细胞(HLEC)中表达的水通道蛋白(AQP)的水平。发现在mRNA水平上没有发现与对照相比的差异，但是在来自白内障患者的晶状体上皮细胞中观察到与对照组相比，AQP1蛋白表达显著增加1.65倍，核性白内障中增加2.1倍。白内障组AQP5相比对照组增加1.47倍。两组中均未观察到AQP1或AQP5表达水平与年龄或性别的关联。结果表明AQP1和AQP5的调节发生在翻译后水平，并支持了AQP1和AQP5在维持晶状体透明度方面的作用。

用基因特异性引物的逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)以及使用特异性抗体的免疫印迹和免疫细胞化学分析来研究AQP5表达和细胞定位。AQP5在角膜角膜细胞和晶状体上皮细胞中的空间表达，体外和离体实验显示PKA诱导AQP5的内化;抑制磷酸激酶A(PKA)可以阻止这种内化［32］。

8 小结

总之，晶状体水通道蛋白在晶状体发育和晶状体内平衡中起着关键作用。水通道蛋白家族在晶状体内具有多样性的功能，如透水性，细胞粘附性等，由于基因突变或与年龄有关的修饰引起的AQPs功能的丢失可导致AQP功能的丧失从而引起白内障。水通道蛋白在晶状体微循环系统中的详细作用需要进一步研究，以更清楚地阐明它们在晶状体的不同区域对正常晶状体和白内障晶状体的整体功能的作用。