慢性脑缺血大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α及β-淀粉样蛋白1-42的表达研究

金平 王经英 邢小炜 林敏 蔡兆伟 许茂盛 孙志超 佟雅涵

阿尔茨海默病（AD）是一种神经系统退行性疾病，具有病因多样、起病隐匿、认知功能随病程进展渐进性损害等特点。脑部出现老年斑（SPs）是AD的主要病理变化之一，其核心成分是β-淀粉样蛋白（Aβ），尤其是Aβ1-42在AD的发生、发展中起重要作用[1]。关于AD的病因研究一直是临床的热点[2]。有研究指出，免疫炎性反应、慢性脑缺血在AD的病情进展中发挥重要作用[3]。笔者团队早期研究发现，在高脂饮食喂养的AD兔模型中，继发于高脂血症的低血流量灌注与脑组织Aβ1-42的沉积存在明显的相关性[4]。因此，笔者有理由假设免疫炎性反应与慢性脑缺血所导致的脑组织Aβ1-42异常沉积有密切关系。本研究通过建立慢性脑缺血大鼠模型，检测其脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子和Aβ1-42的表达水平，分析两者的相关性，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物来源 选用健康成年普通级雄性SD大鼠 16 只，24周龄，体重（180±20）g，由浙江中医药大学动物实验研究中心普通级大鼠实验室[SYXK（浙）2013-0184]提供并饲养于标准笼内，12h/12h明暗交替，饲养温度22～23℃，相对湿度45%～50%，自由饮食。

1.2 实验动物分组和处理 将16只大鼠采用随机数字表法分为模型组和假手术组，各8只。模型组：使用3%戊巴比妥钠，按45mg/kg体重腹腔注射麻醉大鼠，永久结扎大鼠双侧颈总动脉建立慢性脑缺血大鼠模型[5]。手术中使用电热毯维持大鼠肛温在（37.0±0.5）℃，手术后大鼠送至有通风和空调设备的动物房饲养，术后3d连续肌肉注射青霉素20万U/kg体重，以预防感染。假手术组：采用与模型组相同的方法麻醉大鼠，切开其颈部皮肤后分离双侧颈总动脉，但不结扎，后续处理同模型组。

1.3 大鼠局部脑血流（rCBF）检测 使用激光多普勒血流仪分别检测两组大鼠手术前、手术后（30min内）海马CA1区rCBF变化情况，测量点定于大鼠右侧外眦与耳孔连线的中点（对应颅内右侧颞叶海马区域）。具体测量步骤见参考文献[6]。

1.4 大鼠脑组织 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 Aβ1-42表达水平检测 术后4周两组大鼠均使用3%戊巴比妥钠按45mg/kg腹腔注射麻醉后断头处死，再次确认模型组大鼠双侧颈总动脉结扎情况，确保结扎丝线没有滑脱或松弛，颈总动脉被牢固结扎。取出大鼠脑组织并分离海马，使用均质机（法国Birtin公司）制备10%的脑组织匀浆，4℃环境下3 000r/min离心10min，取上清液进行ELISA法检测。使用上海巧伊生物科技有限公司提供的IL-1β、IL-6和TNF-α试剂盒以及南京建成生物工程研究所提供的Aβ1-42试剂盒检测IL-1β、IL-6、TNF-α和Aβ1-42表达水平。测量步骤严格按照使用说明书进行。

1.5 观察指标 （1）比较两组大鼠手术前后rCBF；（2）比较两组大鼠脑组织 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 Aβ1-42表达水平；（3）分析大鼠脑组织 IL-1β、IL-6、TNF-α 表达水平与Aβ1-42表达水平的相关性。

1.6 统计学处理 应用GraphPad Prism 6.0统计软件；计量资料以 表示，组间比较采用两独立样本t检验，组内手术前后比较采用配对t检验；相关性分析采用Person相关；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠手术前后rCBF比较 见表1。

表1 两组大鼠手术前后rCBF比较（ml/min）

由表1可见，手术前两组大鼠rCBF比较差异无统计学意义（P＞0.05），手术后模型组大鼠rCBF明显低于假手术组（P＜0.05）。模型组大鼠手术后rCBF明显低于手术前（P＜0.05），而假手术组大鼠手术前后rCBF比较无统计学差异（P＞0.05）。

2.2 两组大鼠脑组织 IL-1β、IL-6、TNF-α和 Aβ1-42表达水平比较 见表2。

由表2可见，模型组大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子表达水平均高于假手术组，Aβ1-42表达水平亦高于假手术组，两组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 大鼠脑组织 IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平与Aβ1-42表达水平的相关性分析 见图1-3。

表2 两组大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α和Aβ1-42表达水平比较

图1 大鼠脑组织IL-1β表达水平与Aβ1-42表达水平的散点图

图2 大鼠脑组织IL-6表达水平与Aβ1-42表达水平的散点图

图3 大鼠脑组织IL-6表达水平与Aβ1-42表达水平的散点图

由图 1-3可见，大鼠脑组织 IL-1β、IL-6、TNF-α 表达水平与Aβ1-42表达水平均呈正相关（r=0.7755、0.5920、0.5536，均P＜0.05）。

3 讨论

慢性脑缺血是指因各种原因所引起的慢性脑血流灌注不足导致的一组疾病，是AD等导致认知功能障碍疾病的共同病理基础[7]。目前学界普遍认为AD是一种神经退行性疾病，但长时间的脑部低血流灌注会促使AD的发生。Torre[8]提出AD的临界脑低血流灌注阈值学说，指出当脑血流灌注因为各种原因降至一定的阈值以后，便可以通过触发级联反应，使脑组织出现一系列的类似AD的病理改变。早有研究指出，通过结扎大鼠双侧颈总动脉所建立的慢性脑缺血大鼠模型与散发性AD患者在认知功能的损伤、脑血管的异常改变和神经元变性等诸多方面的存在相似[5，8]。研究者还在慢性脑缺血动物模型脑内发现Aβ和淀粉样前体蛋白（APP）浓度明显上升[9-10]，而脑组织的Aβ，尤其是Aβ1-42的异常增高和沉积是AD的特征性主要病理改变之一。

参考Smith等[11]提出的AD脑萎缩假说，笔者团队采用双侧颈动脉结扎的方法成功制备大鼠脑缺血模型，检测两组大鼠脑组织Aβ1-42表达水平。结果显示，模型组大鼠脑组织Aβ1-42水平较假手术组大鼠明显升高，与以往研究结果相符[9-10]。慢性脑缺血可以在提高β-分泌酶活性强化APP的淀粉样途径的同时，降低α-分泌酶活性，从而使非淀粉样途径受到抑制，最终使Aβ蛋白生成增加[10]。Ballabh等[12]指出脑缺血可以使糖基化终产物受体(RAGE)蛋白表达明显增多，RAGE通过内吞或跨膜作用，将脑组织外的Aβ通过血脑屏障转运入脑，使脑组织的Aβ表达水平增高。沉积在小动脉与毛细血管基膜上的Aβ则通过增强内皮素的缩血管作用引起脑组织供血动脉和毛细血管收缩，进一步加重脑的低血流灌注，从而发生互相促进的恶性循环[13]。

神经免疫炎性反应被认为是慢性脑缺血发生、发展过程中的重要环节，发生慢性脑缺血时，颅内的神经免疫炎性细胞星形胶质细胞和小胶质细胞等出现增生和活化，活化后的胶质细胞既对神经元有支持和营养作用，又因分泌大量的TNF-α、IL-1、IL-6等免疫炎性因子而进一步加剧神经免疫炎性反应，使神经元损伤加重[14-15]。本研究结果显示，慢性脑缺血模型大鼠脑组织的IL-1β、IL-6和TNF-α等免疫炎性因子表达水平较假手术组明显增高，这与有关研究的结果相符[14]。

免疫炎性反应贯穿了AD的整个发生、发展过程[16]。Aβ蛋白在脑组织中异常沉积可形成神经炎性斑（SPs）。SPs形成过程中其周围总是存在神经胶质细胞的明显增生、活化以及免疫炎性因子的分泌，提示Aβ可以诱导包括小胶质细胞与星形胶质细胞的活化，促使其释放炎性因子和神经元毒性介质，导致神经元损害[17]。本研究结果显示，大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子表达水平与Aβ1-42表达水平均呈正相关。

有研究发现，IL-1是AD神经免疫炎性反应的标志物，在整个炎性反应过程中发挥着重要的作用，而且与AD的病情严重程度存在明显的相关性[18]。IL-1有IL-1α和IL-1β两种，其中IL-1β的过表达和过度释放是AD免疫炎性损伤的起始因素[19]。过表达的IL-1β不仅可以通过蛋白激酶C（PKC）途径促进APP的合成和裂解[20]，加速脑内Aβ的形成和沉积，还可使环氧化酶（COX1、COX2）合成增多[21]，进而诱导神经元凋亡，导致患者认知功能损伤。

TNF-α的过表达也与AD存在明显的相关性。研究发现，AD患者外周血和脑脊液TNF-α表达水平较正常人群明显升高[22]；TNF-α的过表达可以加速Aβ形成和沉积，导致认知功能损伤[23]。TNF-α不仅可以通过激活Caspases家族成员引起神经元凋亡，还可以诱导花生四烯酸代谢物的释放、脂质过氧化物和氧自由基的产生，破坏细胞膜，导致细胞凋亡；此外TNF-α还可以协同IL-1β诱导IL-6等其他细胞因子的产生[24]。

IL-6在AD疾病起始阶段就可以出现升高，是AD发病的的危险因素[25]。IL-6主要由神经元和胶质细胞合成，可以刺激小胶质细胞和星形胶质细胞释放炎性因子。IL-6可以通过促使神经元APP mRNA表达升高，从而使APP生成增加[26]；还可以通过诱导α2巨球蛋白合成，抑制脑组织Aβ的清除，导致脑组织Aβ的异常沉积。此外，Qiu等[27]发现IL-6还与Aβ在AD的疾病进展中存在协同促进作用。

综上所述，慢性脑缺血大鼠脑组织存在IL-1β、IL-6和TNF-α等免疫炎性因子表达水平与Aβ1-42表达水平升高的现象，且免疫炎性因子表达水平与Aβ1-42表达水平呈正相关。慢性脑缺血或可促使脑组织Aβ1-42表达水平上升和异常沉积，免疫炎性反应或与慢性脑缺血所导致的脑组织Aβ1-42异常沉积有关。当然，本研究也存在不足之处，如未对两组大鼠进行行为学比较，未对大鼠脑内是否存在AD的特征性病理改变进行观察，笔者团队将在今后作进一步研究和更深入的探讨。