LncRNA-MEG3对胃癌生物学特性及铂类化疗敏感性的研究*

郭苹，程鹏，王鹏飞，陈小兵

（1.南阳医学高等专科学校第一附属医院 肿瘤内科，河南 南阳 473007；2.河南省肿瘤医院 消化内科，河南 郑州 450022）

长链非编码RNA（long noncoding RNA, LncRNA）长度＜200 nt，其表达失调可引起多种疾病的发生和发展[1-2]。母系表达基因3（maternal expression gene 3,MEG3）属于非编码RNA，在多种肿瘤中表达降低或缺失，而其高表达可抑制多种肿瘤的增殖和生长[3-7]。胃癌中LncRNA-MEG3的研究相对较少。有研究表明，LncRNA-MEG3在胃癌细胞及组织中表达降低，而过表达LncRNA-MEG3可抑制癌细胞增殖，阻滞细胞周期，但目前LncRNA-MEG3对胃癌细胞凋亡及其化疗敏感性尚不清楚[8-9]。因此，本研究旨在研究过表达LncRNA-MEG3对胃癌细胞生长及顺铂化疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

RPMI 1640培养基（美国Bibco公司），胎牛血清、LipofectamineTM2000及Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（美国Invitrogen公司），顺铂（美国Sigma公司），细胞计数试剂盒（cell counting kit-8, CCK8）（美国Coring公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）试剂盒（上海碧云天公司），STAT3、磷酸化的信号转导与转录因子3（phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3, p-STAT3）、Cyclin D1及Bcl-2抗体（美国Abcam公司），酶标仪（美国Thermo公司），流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。

1.2 细胞培养

人正常胃黏膜上皮细胞GES1和胃癌MKN28、SGC7901、AGS及BGC823细胞购自中国科学院上海细胞库。将在液氮罐中保存的GES1、MKN28、SGC7901、AGS及BGC823细胞解冻，解冻后的细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中传代培养。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应

采用Trizol法提取 MKN28、SGC7901、AGS及BGC823细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA质量，逆转为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），反应体系为20μl，反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，LncRNA-MEG3正向引物：5′-GCCTGCTGCCCATCTACAC-3′，反向引物：5′-CCTCTTCATCCTTTGCCATC-3′；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶正向引物：5′-AGCCACA TCGCTCAGACAC-3′，反向引物：5′-GCCCAATAC GACCAAATCC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR所得Ct值通过2-△△Ct法计算MEG3 mRNA相对表达量。

1.4 转染及效果检测

通过LipofectamineTM2000进行瞬时转染。采用pcDNA3.1-MEG3上调BGC823细胞中LncRNAMEG3的表达。转染前接种1 ml/孔（1×105个/ml）接种BGC823细胞悬液于6孔板，观察细胞的生长状态，细胞达70%生长密度时将构建好的过表达MEG3的质粒转染细胞作为pcDNA3.1-MEG3组，同时转染空白质粒作为pcDNA3.1组，并设置空白对照Control组。严格参照LipofectamineTM2000转染试剂说明书转染。转染后将细胞培养板于37℃、5% CO2培养箱中培养6 h，吸出转染试剂，加入细胞培养基后常规培养。收集转染48 h的细胞并通过qRT-PCR检测细胞中LncRNA-MEG3的表达。

1.5 细胞活力检测

将BGC823细胞分为pcDNA3.1组、pcDNA3.1-MEG3组、顺铂组（50μmol/L顺铂处理细胞）及pcDNA3.1-MEG3+顺铂组（pcDNA3.1-MEG3处理细胞后加入50μmol/L顺铂）。以100μl/孔（5×103个细胞）接种生长至对数期的BGC823细胞于96孔板，在培养箱内常规培养24 h后，将pcDNA3.1-MEG3、pcDNA3.1转染细胞24、48、72及96 h，并按照分组情况处理细胞48 h，每组设置5个平行孔，在每个待测孔中加入CCK8试剂10μl，37℃、5% CO2培养箱中培养1 h，酶标仪测定各组细胞在450 nm波长下的光密度（optical density, OD）值，OD值反映细胞活力，可以间接反映出细胞的增殖能力。实验重复3次。

1.6 细胞凋亡检测

采用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤处理后的细胞，胰酶消化后悬浮细胞于500μl Binding缓冲液中，充分混匀后分别加入Annexin V-FITC和PI各5μl进行荧光染色，室温避光条件下孵育细胞10～15 min，1 h内上机，流式细胞仪检测凋亡率。实验重复3次。

1.7 Western blotting检测

各组细胞中加入适量细胞裂解液，冰上裂解反应30 min后离心取上清，上清即为提取的总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，蛋白样品与上样缓冲液混匀后于100℃水浴锅中变性5 min，每泳道中等量变性蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后切下目的蛋白胶，通过电转移蛋白至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜，将转好的PVDF膜在5%脱脂奶粉封闭液中，于摇床中室温轻摇2 h，洗膜，4℃孵育稀释好的STAT3、p-STAT3、Cyclin D1及Bcl-2一抗，洗膜，加入二抗，室温孵育1 h，洗膜，增强型化学法显色，化学发光仪内曝光并保存图像。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步的两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌和正常细胞的LncRNA-MEG3 mRNA相对表达量比较

以人正常胃黏膜上皮细胞GES1作为对照细胞。以GES1细胞为1，MKN28、SGC7901、AGS及BGC823细胞中LncRNA-MEG3的相对表达量分别为（0.521±0.056）、（0.626±0.061）、（0.443±0.039）和（0.301±0.032）， 各 细 胞 LncRNA-MEG3 mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（F=111.116，P=0.000），LncRNA-MEG3在 BGC823细胞中的表达最低，因此选择BGC823细胞作为研究对象。见图1。

图1 胃癌和正常细胞中的LncRNA-MEG3 mRNA相对表达量比较 （±s）

2.2 3组转染后的细胞中LncRNA-MEG3相对表达量比较

Control组、pcDNA3.1组及pcDNA3.1-MEG3组LncRNA-MEG3相对表达量分别为1、（1.018±0.111）和（8.458±0.526），经单因素方差分析，差异有统计学 意 义（F=576.004，P=0.000）；pcDNA3.1-MEG3组 LncRNA-MEG3表达量高于 Control组（P＜0.05），pcDNA3.1组LncRNA-MEG3相对表达量与Control组比较，差异无统计学意义（t=0.281，P=0.793）。见图2。

图2 3组转染后的细胞中LncRNA-MEG3相对表达量比较 （±s）

2.3 各组不同时间点OD值比较

Control组、pcDNA3.1组及pcDNA3.1-MEG3组在24 h的OD值分别为（0.356±0.028）、（0.322±0.026）和（0.215±0.020），48 h 的 OD 值分别为（0.648±0.047）、（0.621±0.041）和（0.345±0.036），72 h的OD值分别为（0.887±0.062）、（0.851±0.058）和（0.578±0.045），96 h的OD值分别为（1.113±0.074）、（1.012±0.078）和（0.811±0.069），经重复测量设计的方差分析：①不同时间点OD值比较，差异有统计学意义（F=102.713，P=0.000）；②3组OD值比较，差异有统计学意义（F=57.198，P=0.000）；③3组OD值变化趋势比较，差异有统计学意义（F=11.919，P=0.000）（见图3A）。pcDNA3.1组、pcDNA3.1-MEG3组、顺铂组及pcDNA3.1-MEG3+顺铂组处理48 h的OD值分别为（0.636±0.046）、（0.339±0.035）、（0.367±0.038）和（0.209±0.023），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=72.553，P=0.000）。pcDNA3.1-MEG3组和顺铂组OD值分别与pcDNA3.1组比较，差异有统计学意义（t=9.980和9.039，均P=0.000），pcDNA3.1组的细胞活力较高；分别与pcDNA3.1-MEG3+顺铂组比较，差异有统计学意义（t=4.368和5.309，P=0.002和0.001）；pcDNA3.1-MEG3+顺铂组细胞活力较低（见图3B）。

图3 各组不同时间点OD值比较 （±s）

2.4 过表达LncRNA-MEG3或顺铂对胃癌细胞凋亡的影响

pcDNA3.1组、pcDNA3.1-MEG3组、顺铂组及pcDNA3.1-MEG3+顺铂组的细胞凋亡率分别为（1.36±0.35）%、（13.48±1.13）%、（10.02±1.04）%和（18.19±1.22）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=152.679，P=0.000）；pcDNA3.1-MEG3组和顺铂组细胞凋亡率高于pcDNA3.1组（P＜0.05），但低于 pcDNA3.1-MEG3+ 顺铂组（P＜0.05）。见图4、5。

图4 过表达LncRNA-MEG3或顺铂对胃癌细胞凋亡的影响

2.5 过表达LncRNA-MEG3增强顺铂对胃癌细胞STAT3信号通路的影响

图5 4组胃癌细胞凋亡率比较 （±s）

pcDNA3.1组、pcDNA3.1-MEG3组、 顺铂组及pcDNA3.1-MEG3+顺铂组Cyclin D1的蛋白相对表达量分别为（0.273±0.032）、（0.121±0.018）、（0.134±0.016）和（0.061±0.008），Bcl-2的蛋白相对表达量分别为（0.425±0.045）、（0.172±0.019）、（0.231±0.023）和（0.120±0.009），STAT3的蛋白相对表达量分别为（0.410±0.046）、（0.423±0.043）、（0.416±0.044）和（0.422±0.040），p-STAT3 的蛋白相对表达量分别为（0.154±0.017）、（0.083±0.010）、（0.101±0.012）和（0.024±0.007），4组细胞Cyclin D1、Bcl-2及p-STAT3比较，差异有统计学意义（F=57.834、67.890 和 59.251， 均P=0.000），pcDNA3.1-MEG3组和顺铂组细胞Cyclin D1、Bcl-2和p-STAT3表达低于pcDNA3.1组（P＜0.05），但高于 pcDNA3.1-MEG3+顺铂组（P＜0.05）。4组 STAT3比较，差异无统计学意义（F=0.058，P=0.980)。见图6。

图6 过表达LncRNA-MEG3增强顺铂对胃癌细胞STAT3信号通路的影响

3 讨论

随着科学技术的发展，研究者发现非编码蛋白的RNA在基因调控方面发挥重要作用LncRNA是非编码RNA中较为重要的一类，参与肿瘤的生长、侵袭及转移等过程，胃癌中已发现多个LncRNA通过一些复杂的形式影响其发生、发展[10-11]。MEG3是具有肿瘤抑制功能的LncRNA，在正常和肿瘤细胞的发生、发展中发挥重要作用，目前已发现多种人类恶性肿瘤细胞系中MEG3的表达缺失，如前列腺、肝脏等。其表达缺失可促进肿瘤细胞的增殖和生长，而其高表达可抑制肿瘤的生长，如宫颈癌、肺癌中MEG3的高表达可促进癌细胞的凋亡，这提示MEG3在肿瘤发生、发展中的重要作用，但LncRNA-MEG3对胃癌的影响尚不清楚[12-14]。有研究显示，胃癌中MEG3表达下调，与是否发生远处转移密切相关，过表达MEG3可降低细胞增殖能力，阻滞细胞周期[8-9]。

本研究旨在研究MEG3对胃癌细胞凋亡的影响，以人正常胃黏膜上皮细胞GES1作为对照，通过qRT-PCR检测LncRNA-MEG3在人胃癌高分化细胞MKN28、中分化细胞SGC7901和AGS及低分化细胞BGC823中的表达，发现LncRNA-MEG3在BGC823细胞的表达最低，因此选择作为研究对象。将过表达MEG3质粒转染BGC823细胞后，IncRNA-MEG3的表达明显升高，说明可用于后续的实验研究。顺铂是肿瘤治疗中联合化疗常用的一个药物。有研究显示，多种药物或分子靶点联合顺铂可增强顺铂对肿瘤的化疗敏感性[15-16]。本研究中通过对过表达LncRNAMEG3和顺铂单独或联合处理BGC823细胞，发现两者均降低癌细胞活力，且诱导细胞凋亡。这提示过表达LncRNA-MEG3可增强顺铂对胃癌的化疗敏感性。STAT3是重要的细胞内信号转导通路，大量研究显示，在多种肿瘤细胞及组织中STAT3呈现高表达，其高表达可伴随多种抑制凋亡的基因表达上调，从而促进肿瘤发生、发展[17-18]。也有研究发现，利用抑制剂抑制STAT3活性可明显提高肿瘤细胞的凋亡率，因此在多种人类肿瘤的干预治疗中，STAT3途径成为有效的分子标靶[19]。STAT3本身不能激活癌细胞，但可通过对多个靶基因的调控影响癌细胞的生理及病理功能，如CyclinD1、Bcl-2及Survivin[20]。CyclinD1与细胞增殖密切相关，Bcl-2是Bcl-2家族一员，发挥抑凋亡作用。目前有研究发现，可通过降低CyclinD1和Bcl-2的表达抑制胃癌细胞增殖和诱导凋亡[21]。本研究结果显示，过表达LncRNA-MEG3和顺铂可下调磷酸化STAT3、CyclinD1及Bcl-2的表达，两者联合的抑制作用更强，这提示LncRNA-MEG3可通过下调STAT3信号增强顺铂胃癌化疗敏感性。

综上所述，胃癌细胞中LncRNA-MEG3表达降低，过表达LncRNA-MEG3可降低胃癌细胞活力，诱导细胞凋亡，并提高顺铂的化疗敏感性，其机制与下调STAT3信号通路有关。本研究可能为胃癌的治疗提供新的方法，但本研究内容有限，还需更多的实验研究作为支撑。