金钗石斛总黄酮提取工艺优化及抗氧化活性

高华山，陈明辉，齐 光，张 科，佟伟霜

（平顶山学院，河南平顶山 467000）

金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）是兰科石斛属植物，又名金钗石、扁黄草等，是《中华人民共和国药典》［1］收录的名贵石斛属药用植物之一，具备润肺止咳、明目强身、生津益胃等功效。金钗石斛，性微寒，味甘，用于治疗热病伤津、口干烦渴、病后虚热、目暗不明、萎缩性胃炎、浅表性胃炎、慢性结肠炎等，是石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛浸膏溶液、石斛清胃散等制剂的重要配伍［2］。作为传统中药，金钗石斛近年来受到国内外学者高度关注，药理研究表明，金钗石斛具有提高肠道功能［3］、改善记忆衰退［4］、抗肿瘤［5］、抗诱变［6-7］、增强机体免疫能力及降血糖等作用［8-9］。近几十年来，国内外学者对许多种石斛的化学成分进行了研究，发现该属植物所含的化学成分种类丰富，主要包括生物碱类、多糖类、酚类、黄酮类、联苄类、倍半萜类、香豆素以及甾体糖苷类化合物等［10］，其中以生物碱和多糖为研究对象的工作较多。陈志国等对金钗石斛多糖进行了体外抗氧化活性研究，结果表明，金钗石斛粗制多糖和精制多糖均有一定的抗氧化能力［11］。费雯等研究了金钗石斛总多酚的体外抗氧化活性，结果表明金钗石斛总多酚对ABTS、DPPH自由基和羟基自由基活性均有不同程度的清除作用，其清除能力与总多酚质量浓度呈正相关，具有良好的抗氧化能力［12］。但是，目前对于其黄酮类成分的制备工艺及相关活性研究的较少。因此本试验在前期研究基础上采用超声波辅助提取法提取金钗石斛总黄酮并应用响应面法对总黄酮提取工艺影响较大的4个因素即料液比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数进行优化，从而获得经济、科学的提取条件。以维生素C为阳性对照，考察金钗石斛总黄酮对ABTS、DPPH自由基和羟基自由基的清除作用，以期为进一步探讨其药理活性和开发利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 仪器

UVmini-1240紫外可见分光光度计，日本岛津生产；KQ3200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司生产；SHB-ⅢS型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸易有限公司生产；旋转蒸发仪，上海广英公司生产；102-1型恒温鼓风干燥箱，永兴仪器有限公司生产。

1.2 材料

金钗石斛，购自平顶山张仲景大药房，药材干燥后粉碎过80目筛，贮存备用；芸香苷标准品，北京中科质检技术有限公司生产；DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司生产；ABTS自由基［2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）］，上海金穗生物科技有限公司生产；羟自由基试剂盒，南京建成生物工程研究所生产；维生素C标准品，北京中科质检技术有限公司生产；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 测定方法

1.3.1 金钗石斛总黄酮的提取与测定 准确量取2.0 g乙醇作为溶剂，在一定温度下利用超声波处理一定时间，趁热抽滤，用相应的提取溶剂补足损失，作为待测液。精确量取1.0 mL待测液于10 mL的比色管中，按标准曲线的测定方法测定待测液的吸光度，计算黄酮含量。公式如下：

式中：C为待测液中的黄酮浓度，mg/mL；V为黄酮提取液体积，mL；N为待测液的稀释倍数；m为金钗石斛样品干质量，取2.0 g。

1.3.2 标准曲线的绘制 精确称取芸香苷对照品20.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解，再用50%乙醇稀释至100 mL，得0.2 mg/mL芸香苷对照品溶液，分别量取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芸香苷对照品溶液于6个10 mL比色管中，分别加入50%乙醇溶液使之成5 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，分别用50%乙醇稀释至10 mL，摇匀后放置15 min，用不加芸香苷对照品溶液的第1支管作空白，用紫外可见分光光度计在510 nm处测其吸光度，以吸光度为纵坐标、芸香苷浓度为横坐标，绘制标准曲线［13］，得y＝13.12x+0.042 6，r2＝0.999 9。结果表明，芸香苷在浓度0.02～0.10 mg/mL范围内与吸光度具有良好的线性关系。

1.4 试验方法

1.4.1 精密度、重复性、稳定性与精确度试验 精确量取供试品溶液1 mL，按“1.3.2”节中的测定方法操作，测定吸光度，连续测6次，吸光度的RSD＝1.03%，说明仪器精密度较好。将供试品溶液分别放置0、2、4、8、12、24 h后，测定总黄酮含量，结果显示其RSD＝3.13%（n＝6），说明供试品溶液在24 h内的稳定性较好。按“1.3.1”节中总黄酮的提取方法平行制备6份样品，按“1.3.2”节的测定方法操作，测定吸光度，结果吸光度的RSD＝2.42%，表明该测定方法的重复性良好。精确称取6份已知含量的样品粉末2.0 g，分别加入一定量的芸香苷对照品溶液（0.2 mg/mL），按“1.3.1”节总黄酮的提取方法制成待测液，再按“1.3.2”节的方法测定吸光度，计算含量及回收率，其平均回收率为92.5%（RSD＝3.60%，n＝6），表明该方法准确度良好。

1.4.2 金钗石斛总黄酮单因素试验提取工艺优化 以超声法提取金钗石斛总黄酮，考察料液比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数对金钗石斛黄酮提取的影响。

2 结果与分析

2.1 单因素对金钗石斛黄酮提取量的影响

2.1.1 料液比对黄酮提取量的影响 准确称取金钗石斛粉末2.0 g，以体积分数为60%乙醇、温度为55℃条件下浸提30 min，考察1 g∶10 mL、1 g∶20 mL、1 g∶30 mL、1 g∶40 mL、1 g∶50mL 5种不同料液比条件下对黄酮提取量的影响。从图1-A可以看出，金钗石斛黄酮提取量随溶剂的增加呈先增大后降低的趋势，料液比在1 g∶20 mL时，黄酮提取率达到最大值，之后随溶剂的增加而呈现平缓下降趋势。原因可能是料液比在1 g∶20 mL时，溶剂中黄酮的溶解度已经趋于饱和，即使继续增加溶剂用量，黄酮提取量也没有显著提高，故选最佳料液比为1 g∶20 mL。

2.1.2 温度对黄酮提取量的影响 准确称取金钗石斛粉末2.0 g，以体积分数60%乙醇、料液比1 g∶20mL浸提30min，考察45、55、65、75、85℃5种不同温度条件下对黄酮酚提取量的影响。从图1-B可以看出，在温度未达到65℃时，黄酮提取量随温度升高不断升高；温度超过65℃后，黄酮提取量随温度升高反而下降。这可能是由于温度小于65℃时，物料的黏滞度减小，黄酮物质很容易溶解析出，黄酮提取量随温度升高而增大，至65℃时达到最高，而温度超过65℃时，较高的温度可能会破坏黄酮结构造成其提取量下降，故而选择提取温度为65℃左右较为合理。

2.1.3 提取时间对黄酮提取量的影响 精确称取金钗石斛粉末2.0 g，在体积分数60%乙醇、料液比1 g∶20 mL、温度55℃条件下考察10、20、30、40、50 min 5种不同提取时间对黄酮酚提取量的影响。从图1-C可以看出，黄酮提取量随着时间延长反而呈现逐渐下降趋势，在提取时间为10 min时，黄酮提取量最高；提取20～30 min，黄酮提取量下降较快，在30～50 min时基本保持不变。10 min时黄酮提取量最高且节约时间，故而选取提取时间为10 min左右。

2.1.4 乙醇体积分数对黄酮提取量的影响 准确称取金钗石斛粉末2.0 g，在料液比1 g∶20 mL、温度55℃条件下浸提30 min，考察50、60、70、80、90% 5种不同乙醇体积分数下对黄酮酚提取量的影响。从图1-D可知，黄酮提取量随乙醇体积分数的增加呈现先升高再降低的趋势，在乙醇体积分数达到80%时达到最大。这可能是因为随着乙醇体积分数的增加，材料细胞的溶胀增强，促进提取试剂有效地向细胞内渗透，从而增加提取率［14］。另外可能是由于金钗石斛黄酮类化合物的结构较为复杂，随着乙醇体积分数的提高，与醇类极性相似的黄酮类物质析出更多，溶剂极性过大或过小对总酚提取均有一定影响。从本试验结果来看，当乙醇体积分数为80%时，黄酮提取量达最大值，故选取乙醇体积分数为80%左右。

2.2 金钗石斛总黄酮提取响应面试验设计及优化

2.2.1 响应面试验设计 根据单因素试验结果，由Design-Expert8.0.6统计分析软件设计出试验方案，以金钗石斛黄酮提取量为响应值，以料液比（X1）、提取温度（X2）、乙醇体积分数（X3）为自变量，建立4因素3水平中心组合试验设计共包括17个试验方案，其中12个析因试验点、5个中心试验点，用以计算试验误差。因素水平分析选取见表1，试验设计及结果见表2。

2.2.2 回归方程拟合及方差分析 应用Design-Expert 8.0.6对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到料液比X1、提取温度X2、乙醇体积分数X3与金钗石斛总黄酮含量之间的二次多项回归方程为：Y＝0.51+0.022X1+0.027X2+0.029X3-0.045X21-0.024X22-0.043X23-0.028X1X2-0.036X1X3+0.041X2X3，R2＝0.995 6，＝0.990 0，由方差分析可知回归方程模型极显著（P＜0.000 1），说明该模型与实际拟合良好，试验方法可靠，失拟项P值为0.074 8＞0.05，不显著，说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，可以用该回归方程代谢试验真实点对试验结果进行分析。结果表明，料液比（X1）、提取温度（X2）、乙醇体积分数（X3）对总黄酮提取量的工艺影响极显著；二次项料液比、提取温度、乙醇体积分数对总黄酮提取量的曲面效应均极显著；比较各因子间料液比与乙醇体积分数交互项、提取温度与乙醇体积分数交互项对响应值影响显著，各因素对响应值显著性的排序为X3＞X2＞X1。

表1 响应面法试验因素水平编码

表2 中心试验设计及试验结果

2.2.3 各因素的交互作用 将其中1个因素固定在0水平，经软件Design-Expert 8.0.6获得其他2个因素交互作用和对金钗石斛黄酮量的影响。“3D”图坡度越大越陡峭，说明二者交互最有越强；等高线的想着趋向于椭圆且椭圆轴线与坐标轴的角度越大，交互作用越明显。由图2可知，响应面坡度陡峭，等高线呈椭圆，说明料液比（X1）和乙醇体积分数（X3）对黄酮提取率的影响均较大。由响应面的等高线图2可知，料液比1 g∶20 mL～1 g∶30 mL、乙醇体积分数80%～90%的范围内黄酮提取量较高。料液比（X1）和乙醇体积分数（X3）交互作用显著，可能是因为料液比会影响溶质分子质量浓度，因而对金钗石斛黄酮的提取量产生交互影响。不同因素对金钗石斛黄酮提取量的影响非简单的线性关系。

由回归方程优化得出因素水平的最优组合，并将各因素水平转换为实际值，得到金钗石斛黄酮提取的最佳工艺参数为：料液比1 g∶15.43 mL、提取温度75℃，乙醇体积分数为89.96%。考虑到实际操作可行性，将最佳提取工艺优化为：料液比1 g∶15 mL，提取温度75℃，乙醇体积分数为90%。

2.2.4 验证试验 根据修正的最佳工艺条件，进行6次重复试验，测得金钗石斛中总黄酮的提取量为0.551 5 mg/g（RSD＝1.24%，n＝6），与预测的黄酮提取量0.551 4 mg/g较为接近，表明运用响应面法设计优化得到的模型参数准确可靠。

2.3 抗氧化性试验

2.3.1 ABTS自由基清除活性 将维生素C标准品配制成浓度为3 000.00、1 500.00、750.00、375.00、187.50、93.75、46.875μg/mL的样品液。分别取维生素C及各样品液0.1 mL，加入1 mL ABTS溶液，充分混合，室温避光放置20 min，用紫外分光光度计在734 nm处测定吸光度。超纯水为空白对照用，重复3次［15-16］。按下式计算清除率：

表3 回归模型的方差分析

样品和维生素C对ABTS自由基的清除能力见图3-A，结果表明，样品对ABTS自由基的清除能力呈现一定的浓度依赖性，当浓度达到1 500μg/mL的时候，金钗石斛黄酮对ABTS自由基的清除能力接近于维生素C，在更高浓度时（2 000～3 500μg/mL），其清除能力达100%。表明金钗石斛黄酮对ABTS自由基有良好的清除能力。通过SPSS软件计算维生素C 和金钗石斛的IC50值分别为343.56、684.89μg/mL，表明金钗石斛黄酮对ABTS自由基的清除能力仍低于维生素C。

2.3.2 DPPH自由基清除活性 将维生素C标准品及金钗石斛黄酮提取液配制成浓度为3 000.00、1 500.00、750.00、375.00、187.50、93.75、46.875μg/mL的样品液。分别取维生素C及各样品液0.3 mL，加入0.9 mL DPPH甲醇溶液（0.1 mmol/L），室温暗反应30 min，用紫外分光光度计在517 nm处测定吸光度［17-18］。空白对照用超纯水代替样品液，重复3次。按下式计算：

样品和维生素C对DPPH自由基的清除能力见图3-B，结果表明，样品对DPPH自由基的清除能力与其浓度呈正相关，在0～750μg/mL浓度范围内，随着黄酮浓度的增加，对DPPH自由基的清除能力显著增强。当浓度达到1 000μg/mL时，金钗石斛黄酮对DPPH自由基的清除能力接近最大值，约90%。表明金钗石斛黄酮对DPPH自由基有良好的清除能力。但通过SPSS软件计算维生素C和金钗石斛的IC50值分别为139.23、425.34μg/mL，表明金钗石斛黄酮对DPPH自由基的清除能力仍低于维生素C。

2.3.3 清除羟自由基活性 将维生素C标准品及金钗石斛黄酮提取物配制成浓度为3 000.00、1 500.00、750.00、375.00、187.50、93.75、46.875μg/mL的样品液。采用羟自由基试剂盒检测，用紫外分光光度计在550 nm处测定吸光度。空白对照用超纯水代替样品液，重复3次。计算清除率：

样品和维生素C对羟自由基的清除能力如图3-C，结果表明，维生素C对羟自由基有很好的清除能力，且与其浓度呈正相关，随着维生素C浓度的增加，对羟自由基的清除能力显著增强。金钗石斛黄酮对羟自由基的清除能力也呈现一定程度的浓度依赖性，但其羟自由基清除能力低于阳性对照的维生素C，在高浓度4 000μg/mL时，其清除率为51.8%，表明金钗石斛黄酮具有一定的清除能力。通过SPSS软件计算维生素 C 和金钗石斛的 IC50值分别为438.46、1 046.43μg/mL，表明金钗石斛黄酮对羟自由基的清除能力较对ABTS和DPPH这2种自由基的清除能力弱。

2.4 金钗石斛黄酮对间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的保护作用

将第3代的MSC细胞接种96孔板，细胞浓度为1.5×105mL，每孔加入100μL细胞液，边缘孔加无均水保湿，5%CO2培养箱中培养24 h，换液，每孔加入含不同浓度药物（10、20、40、80、160、320μg/mL）的完全培养液100μL，每浓度设置5个复孔，空白组和H2O2组加入100μL完全培养液，培养箱继续培养24 h，避光条件，每孔加入6 mmol/L H2O210μL，空白组不加H2O2，培养2 h后取出，每孔加20μL细胞计数试剂盒-8（CCK-8），继续培养2 h，与490 nm处酶标仪测定各孔吸光度。试验结果表明，在H2O2能够明显引起MSC的伤，与空白组相比具有显著差异（P＜0.001）。与H2O2比较，除10μg/mL浓度组外，金钗石斛黄酮均能不同程度地保护MSC免受H2O2的损伤，黄酮浓度20μg/mL时开始有保护作用，到80μg/mL时保护作用最强，活性达到正常细胞的80%，损伤保护作用结果见图4。

3 讨论与结论

采用响应面法对金钗石斛黄酮的提取条件进行优化，建立了黄酮提取量的回归模型，由该模型优化的黄酮提取条件为提取时间10min、料液比1 g∶15 mL，提取温度75℃，乙醇体积分数为90%。根据修正的最佳工艺条件，进行6次重复试验，测得黄酮提取量的均值为（0.551 5±0.000 4）mg/g，与模型预测值相符，进一步验证了该模型的可靠性。抗氧化活性试验表明，金钗石斛黄酮对ABTS自由基、DPPH自由基的清除作用明显，对羟自由基有一定的清除能力。金钗石斛黄酮清除ABTS自由基、DPPH 自由基的IC50值分别为684.89、425.34μg/mL，说明金钗石斛黄酮具有较好的抗氧化活性，在天然抗氧化剂等领域具有较好的开发潜力。