基于标准汤剂的川黄柏配方颗粒中间体工艺的优化

徐玉玲， 谭悦琪， 彭 艳， 韩 啸， 余 杰， 刘 涛

（成都大学药学与生物工程学院，四川成都 610106）

黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，习称 “川黄柏”[1］，始载于 《神农本草经》，列为上品，主要分布于四川东部、贵州、湖北、云南、湖南西北部[2］，其味苦、寒，归肾、膀胱经[1］，为临床常用的中药之一，具有清热燥湿、泻火解毒、退虚热之功效。黄柏生物活性成分除了提取物、总生物碱以外，还包括盐酸小檗碱、黄柏碱、木兰碱、巴马汀、药根碱、黄柏酮、黄柏内酯等单体化合物[3］，其中盐酸小檗碱因具有较好的药理作用，临床应用广泛。

中药饮片标准汤剂是指以中医药理论为指导，选取道地药材或主产区药材，经加工炮制成合格饮片后再经标准化工艺制备而成的中药饮片水煎剂[4］。为规范中药配方颗粒的质量控制与标准研究，加强标准化工作，国家药典委员会于2016年8月颁布 《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》（征求意见稿）[5］，要求中药配方颗粒应具有标准汤剂的基本属性，在制备中除成型工艺外，其余应与传统汤剂基本一致，即以水为提取溶剂，通过物理方法进行固液分离、浓缩、干燥、颗粒成型等工艺生产，并且中药配方颗粒药效物质应与中药饮片水煎汤剂基本保持一致。

本实验以文件中标准汤剂的制备方法为基础，盐酸小檗碱为指标成分，其转移率及出膏率为评价指标，对川黄柏配方颗粒中间体进行提取、浓缩、干燥工艺优化，为建立符合其特点的制剂工艺奠定基础。

1 材料

iChrom P5100型高效液相色谱仪 （大连依利特分析仪器有限公司）；BS-6KH型电子天平 （上海友声衡器有限公司）；FA2004型电子分析天平 （上海良平仪器仪表有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵 （郑州杜甫仪器厂）；RE-501型恒温水油浴锅、旋转蒸发器 （成都康宇科技有限公司）；MH-3000型可调式电热套 （北京科伟永兴仪器有限公司）；FA-1A-50型冷冻干燥机 （北京博医康实验仪器有限公司）；101-1-S型电热鼓风干燥箱 （成都雅源科技有限公司）。

川黄柏 （批号20170809）购自成都市荷花池中药材市场，经成都大学药学与生物工程学院刘涛研究员级高级工程师鉴定为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮。盐酸小檗碱对照品 （批号wkq16072302，CAS：633-65-8，含有量＞98%）购自四川省维克奇生物科技有限公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 盐酸小檗碱含有量测定

2.1.1 色谱条件 Supersil ODS2色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈-0.1% 磷酸 （50 ∶50）（每100 mL加0.1 g十二烷基磺酸钠）；检测波长265 nm；柱温25℃；体积流量1.0 mL／min；进样量10 μL。色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取盐酸小檗碱对照品7.12 mg，置于100 mL量瓶中， “2.1.1”项下流动相稀释至刻度，摇匀，即得 （质量浓度71.2 μg／mL）。

2.1.3 供试品溶液制备 精密移取提取液1 mL或精密称取干浸膏0.1 g，置于50 mL量瓶中，“2.1.1”项下流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

图1 盐酸小檗碱HPLC色谱图

2.1.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得盐酸小檗碱峰面积RSD为1.24%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验 取提取液 （批号20170809）适量，按 “2.1.3”项下方法制备6份供试品溶液，在 “2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得盐酸小檗碱含有量RSD为2.08%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 取供试品溶液适量，于0、2、4、6、8、12 h在 “2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得盐酸小檗碱峰面积RSD为2.85%，表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.7 线性关系考察 精密移取对照品溶液2、4、6、8、10 mL，置于10 mL量瓶中，“2.1.1”项下流动相稀释至刻度， 摇匀， 制得 14.24、 28.48、 42.72、 56.76、 71.20 μg／mL溶液，在 “2.1.1”项色谱条件下进样10 μL测定。以峰面积 （Y）对溶液质量浓度 （X）进行回归，得盐酸小檗碱方程为 Y＝31.385X+13.877（r＝0.999 9），在 14.24～71.20 μg／mL范围内线性关系良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密移取含有量已知的提取液0.5 mL，置于50 mL量瓶中，精密加入2 mL对照品溶液（0.611 6 mg／mL），按 “2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，平行6份，在 “2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，盐酸小檗碱平均加样回收率为100.72%，RSD为1.85%。

2.1.9 盐酸小檗碱转移率测定 取 “2.1.3”项下供试品溶液进行定量测定，计算盐酸小檗碱总量，并与相应饮片中盐酸小檗碱总量相除，即为该成分转移率。

2.2 标准汤剂制备[6］称取饮片120 g，加水煎煮2次。第1次加入10倍量水浸泡30 min，煮沸后再煎煮20 min，趁热过滤；第2次药渣再加入8倍量水，煮沸后再煎煮20 min，趁热过滤，合并2次滤液，减压浓缩 （≤50℃，-0.09 MPa）至挂壁状，倒出，冰柜中预冻 （-10℃）过夜，冷冻干燥，即得。

2.3 中间体工艺优化

2.3.1 提取工艺

2.3.1.1 提取溶剂选择 中药配方颗粒的制备应与传统汤剂基本一致，而且川黄柏的主要化学成分为生物碱盐类，易溶于水，故选择提取溶剂为水。

2.3.1.2 浸泡时间选择 称取饮片4份，每份50 g，加入8倍量水浸泡0、0.5、1、2 h，提取2次，每次1 h。结果，盐酸小檗碱转移率分别为 62.41%、73.90%、68.33%、75.02%，可见未浸泡时转移率较浸泡后低，并且浸泡时间大于0.5 h后无明显差异，综合考虑，故选择浸泡时间为30 min。

2.3.1.3 正交试验 称取饮片9份，每份50 g，以加水量、提取次数、提取时间为影响因素，盐酸小檗碱转移率及出膏率为评价指标，正交试验优化提取工艺。因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平

表2 试验设计及结果

表3 方差分析

由表3可知，因素A无显著影响 （P＞0.05），因素B、C有极显著影响 （P＜0.01），各因素影响程度依次为C＞B＞A，结合直观分析结果及实际操作，确定最优提取工艺为A1B3C3，即加8倍量水提取3次，每次2 h。

然后，取同一批饮片3份，分别为50、100、200 g，按 “2.3.1.3”项下优化工艺进行验证试验。结果，盐酸小檗碱转移率分别为 83.48%、91.51%、85.50%，RSD为4.81%；出膏率分别为27.95%、28.38%、28.20%，RSD为0.77%，表明工艺稳定可行。

2.3.2 浓缩工艺 将 “2.3.1.3”项下验证试验中3份提取液合并混匀，取4份，每份200 mL，倒入洁净干燥敞口锥形瓶中，于50、60、70、80℃水浴上浓缩2 h，冷却后补足减失的质量。结果，盐酸小檗碱含有量分别为4.23%、4.26%、4.30%、4.25%，表明其转移率随浓缩温度的变化不明显，综合考虑浓缩时间等因素，选择浓缩温度为80℃。

然后，取同一批饮片3份，每份50 g，按 “2.3.1.3”项下优化工艺进行提取，药液减压浓缩 （80℃、-0.09 MPa）20 min后补足减失的质量。结果，盐酸小檗碱转移率分别为 82.74%、83.46%、76.83%，RSD为4.49%，表明工艺稳定可行。

2.3.3 干燥工艺 取饮片100 g，加8倍量水提取3次，每次2 h，合并滤液，减压浓缩 （80℃、-0.09 MPa）至挂壁状，倒出稠膏，均分3份，分别进行常压干燥 （80℃）、减压干燥 （80℃、-0.08 MPa）、冷冻干燥，得干浸膏。结果，盐酸小檗碱含有量分别为3.20%、3.23%、3.21%，可知3种干燥工艺无明显差异，由于冷冻干燥所得样品质地疏松，加水后能迅速溶解，而且在真空状态下干燥浸膏时不易氧化，有利于长期贮存，故选择干燥工艺为冷冻干燥。

然后，将 “2.3.2”项下验证试验中的3份提取液继续浓缩至挂壁状，倒出，冰柜中预冻 （-10℃）过夜，冷冻干燥，得干浸膏。结果，盐酸小檗碱转移率分别为80.82%、80.80%、83.73%，RSD为2.06%，表明工艺稳定可行。

2.3.4 工艺比较 将标准汤剂制备工艺、配方颗粒中间体工艺进行比较，结果见表4，可知相较于标准汤剂，配方颗粒中间体盐酸小檗碱转移率提高61.78%，出膏率提高54.75%。

表4 工艺比较结果

3 讨论

自古以来，大多数中药在临床上的应用均以水为溶剂进行提取，本实验也将川黄柏配方颗粒提取方法明确为水提，使其与标准汤剂一致，但这在某种意义上限制了各类先进提取工艺在配方颗粒中的应用，阻碍了相关生产技术的进步，放弃了中药饮片中水溶性不好的成分[7］。李玲慧等[8］发现，70%乙醇回流提取可获得较高转移率的盐酸小檗碱；刘丽梅[9］等采用75%乙醇回流提取，河北安国黄柏提取物中总生物碱含有量及转移率均显著提高。目前，当配方颗粒中间体工艺中有效成分转移率高于标准汤剂时，有学者认为应该调整其生产参数，使其有效成分转移率与标准汤剂一致[10］，但这与目前新药研发过程中的认知不完全吻合。中医药发展本身就是随着人类对外界事物的认知逐渐完善成熟的过程，课题组认为如果配方颗粒所用溶剂、出膏率、成分转移率等指标与标准汤剂一致，则其中间体工艺与后者制备工艺应完全一致，无法体现出中医药与时俱进的特点，同时 《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》（征求意见稿）（《技术要求》）中有还有一些值得探讨的地方[5］，故配方颗粒中间体工艺研究值得业内人士共同探讨，以促进产业健康发展。

川黄柏为干燥树皮，体轻，质硬， 《技术要求》中规定 “待煎饮片应先行浸泡，浸泡时间应根据饮片的质地确定，一般不少于30 min”[6］，故需考察浸泡时间是否会影响提取后的质量或川黄柏中盐酸小檗碱变化。赵学敏在《枟本草纲目拾遗枠》中指出 “今药肆所售，仙半夏，惟将半夏浸泡，尽去其汁味……全无本性，是无异食半夏渣滓，何益之有”，“多泡无益”早已被认知，历代医家大多主张 “少泡多润”[11］。对于一些特殊药材，如黄芩中所含黄芩酶在适宜温度下，可在水溶液中将黄芩苷酶解为苷元类，若满足一定药材粒度条件，则能在一定时间内将其完全酶解[12］；大青叶中大青素B易被共存的酶或弱碱水解生成吲哚醇，从而氧化成靛蓝，发生性质上的改变[13］，可见浸泡与否和药材自身特性有极大的关系，而非标准汤剂规定的应先行浸泡。

川黄柏为清热燥湿药， 《技术要求》中规定清热类中药材标准汤剂的煎煮时间为20 min[6］，而本实验通过正交试验确定最终提取时间为120 min，与文献 [14-15］报道一致，与标准汤剂差异较大。一方面，虽然标准汤剂源于传统中药汤剂，但既然中药配方颗粒中间体工艺建立在标准汤剂制备工艺之上，就不应拘束于传统煎药流程；另一方面，作为一种新型饮片，中药配方颗粒应同样具备与传统饮片一致的 “性味”特征，其开发不能简单地理解为中药颗粒剂开发，而应建立一套符合其特点的工艺，最大限度 “保味存性”是每个工艺环节的要求，故应使中药配方颗粒与传统中药饮片相比做到 “变形而不变性”[16］。

浓缩、干燥是标准汤剂制备工艺中增加的2个重要工序， 《技术要求》中规定 “标准汤剂的浓缩温度不超过50℃”[6］。温度越低，时间越短，越有利于成分稳定，但本实验中盐酸小檗碱转移率并未随浓缩温度变化而发生明显改变，故在实际浓缩过程中应综合考虑受热状况对提取液中成分的影响，而非单一的规定浓缩温度。中药浸膏的传统干燥方法主要有鼓风烘箱干燥和普通真空干燥[17］，《技术要求》中规定 “标准汤剂的干燥一般采用冷冻干燥方法制备为宜”[6］，故本实验考察了常压干燥、减压干燥、冷冻干燥3种方法，最终确定为冷冻干燥，与标准汤剂一致，该方法由于在低温下操作，能有效保护药液中有效成分，适用于易氧化或热敏性药品的干燥，但设备复杂、耗能大、干燥成本高等因素限制了它在中药工业中的应用[18］。另外，喷雾干燥干燥效率高，对有效成分破坏少，所得浸膏粉细腻、均匀、含水量低，而且浸膏粉溶解性好，适合工业化大生产，越来越被广泛用于中药浸膏干燥[17］，但该方法易出现物料粘壁而导致物料损失，而且难以处理高浓度、高黏性的中药浓缩液[19］，故它在川黄柏配方颗粒制备中的应用还有待进一步研究。

综上所述，本实验对川黄柏配方颗粒中间体工艺的优化建立在标准汤剂制备工艺之上，并明确了提取、浓缩、干燥等环节的关键要素，可见当前技术要求尚不成熟，固定的煎煮、浓缩、干燥等流程所制备的标准汤剂仅为一个参考，而非绝对性指导。因此，中药配方颗粒的制备应从中药材本身出发，遵循其特征，对相关工艺不断进行深入研究和完善，为加速该类制剂发展及中药现代化奠定坚实基础。