‘岷县黑裘皮羊’不同组织中HSP60基因的表达定位

祁磊，张全伟，王琪，李宗帅，杜嘉祥，张勇，崔焕忠

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130117；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

1962年，CARPER[1]等首次在果蝇体内发现一类高度保守蛋白，即热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs).HSPs是机体细胞受到内外环境中物理、化学、生物等因素刺激时，选择性合成的一类保护蛋白[2].正常生理条件下，HSPs参与调控热应激反应，此外，HSPs作为分子伴侣，还参与了一些重要的细胞生理活动，如蛋白转位，装配和折叠[3]等.根据相对分子质量大小，将HSPs分为小分子HSP、HSP40、HSP60、HSP90、HSP110和泛素等6个亚类.其中HSP60作为HSPs家族中最为保守的亚类，广泛存在于真核生物及原核生物中， 发挥重要的调控作用[4].与该家族其他成员类似，HSP60参与新生肽链的结合与稳定，对变性蛋白有修复或加速其降解的作用.在冷、热、缺氧、有机毒物，重金属等体外环境应激下，HSP60表达明显增加，且发生移位[5].孙培明等[6]发现，机体受热刺激时，HSP27、HSP60、HSP70和HSP86在心肌细胞中表达定位存在差异，但均可见免疫阳性表达，结果提示HSPs可能对心肌细胞保护发挥重要作用.于纪棉[7]等发现，HSP60在肉鸡抗逆过程中具有重要意义，是心肌细胞在热应激初期反映损伤大小的重要分子标志.真核生物中，HSP60主要存在于线粒体中，少部分存在于胞浆内，线粒体中HSP60高表达对细胞抗凋亡发挥重要的作用，其表达量的高低直接影响线粒体内促凋亡因子和抗凋亡因子的表达[8].原代培养的心肌细胞中，通过免疫共沉淀研究发现HSP60与Bcl-xl和Bax表达密切有关，当该通路激活时，HSP60表达上调，使得抗凋亡因子(Bcl-2和Bcl-xl)的表达随之上调，而促凋亡因子(Bax和Bad)的表达则下调，影响细胞凋亡[9].近年来，HSP60基因已成为HSPs家族中的研究热点.目前，已见鸡[10]、鼠[11]、人[12]等有机体中HSP60的报道，但绵羊HSP60的功能至今未见报道.

‘岷县黑裘皮羊’是我国一种极为重要的地方绵羊品种，主要分布于甘肃境内洮河两岸，又以岷县居多，其肉质鲜嫩，皮毛质地优良.近年来，纯种‘岷县黑裘皮羊’数量有明显的消减趋势，且日益严重的病害问题和不断恶化的自然条件给‘岷县黑裘皮羊’养殖业造成了重大经济损失[13].HSPs是生物体内的重要抗感染和抗逆基因,‘岷县黑裘皮羊’HSP60的深入研究可有助于‘岷县黑裘皮羊’养殖业的健康发展.本试验通过荧光定量PCR、免疫组织化学和Western-blotting的方法检测HSP60基因在绵羊各组织中的表达分布和表达差异，有助于深入了解其作用，为进一步研究HSP60基因在绵羊抗逆性上提供基础资料和理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及样品采集 健康雄性‘岷县黑裘皮羊’(2岁，n=3)，屠宰后分别采集心脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸和肌肉组织，部分组织迅速保存于液氮中；部分组织置于4%多聚甲醛固定保存.

1.1.2 主要试剂 HSP60抗体购自Santa公司(mouse polyclonal to HSP60，sc-59567)，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo公司，SYBR Green qPCR Mastermix购自DBI公司，DAB显色试剂盒和免疫组化试剂盒(Code:SP-0022)购自北京博奥森生物技术有限公司，TransZOL UP RNA提取试剂盒(code：ET111-01)购自北京全式金生物技术公司,高效RIPA裂解液(code：R0010)购自北京索莱宝科技有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒(code：P0012)购自上海碧云天生物技术有限公司，其他试剂均为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR 以GeneBank公布的绵羊HSP60mRNA序列为参照，使用Primer Premier 5.0设计特异性引物(表1).

Trizol法提取各组织Total RNA，反转录形成cDNA，以其为模板，对‘岷县黑裘皮羊’HSP60基因表达检测.反应体系为20 μL： cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、2×TranStart Tip Green qPCR SuperMix10 μL、ddH20 8 μL.扩增程序采用三步法：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s；共45个循环.具体步骤参照文献[14].每个样品重复3次，反应结束后扩增曲线和溶解曲线用于判定，采集Ct值，结果采用2-△△ct法进行统计分析.

表1 HSP60和β-actin基因引物序列信息

1.2.2 免疫组织化学染色 4%多聚甲醛溶液固定的组织经石蜡包埋、组织切片、烤片、脱蜡、抗原修复后；经3% H2O2室温孵育30 min；鼠源HSP60一抗(1∶300)4 ℃孵育过夜；阴性对照用PBS代替一抗；二抗(1∶2 000)37 ℃孵育30 min；DAB显色、苏木素复染，盐酸酒精返蓝；二甲苯透明、油性树脂封片.随机选取10个视野，Image-Pro Plus 6.0软件扫描其灰度值进行统计学分析.

1.2.3 蛋白免疫印迹 RIPA法提取各组织总蛋白，BCA测定蛋白浓度，每孔上样量为30 μg，80 V恒压电泳，电转移法(100 v恒压，100 min)将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)；5%脱脂奶粉室温封闭2 h，鼠抗HSP60(1∶3 000)和兔抗β-actin(1∶2 000)一抗4 ℃孵育过夜；次日，兔抗鼠和羊抗兔二抗(1∶4 000)

37 ℃孵育3 h，化学发光法ECL显影并于暗室曝光.经Image J软件扫描其灰度值进行统计学分析.

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 ‘岷县黑裘皮羊’不同组织HSP60mRNA表达

根据设计引物PCR扩增‘岷县黑裘皮羊’HSP60和β-actin序列，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在246 bp和184 bp处可见单一明亮的条带(图1-A).结果可排除引物二聚体对目的基因△Ct值得影响.实时荧光定量PCR结果显示HSP60mRNA在6个组织中均有表达，心脏组织中HSP60表达量明显高于其他组织(P<0.01)，随后依次为肺脏、肾脏、睾丸和肌肉，脾脏表达量最低(图1-B).结果表明HSP60在绵羊各组织器官中的表达存在差异性，从心脏组织中的表达量推测HSP60可能对保护心肌细胞起重要作用.

A：HSP60基因和内参基因β-actin基因实时荧光定量PCR产物凝胶电泳检测结果B：绵羊不同组织器官中HSP60 mRNA的相对表达量；M:Marker 750bp.不同字母肩标表示组间差异极显著(P<0.01)；相同字母肩标表示组间差异不显著(P>0.05).A:The PCR results of HSP60 and β-actin，B:Relative HSP60 mRNA expression in different tissues and organs of sheep；M:Marker 750 bp.The different letters mean significant difference between the groups(P<0.01);The same letters mean no difference between the groups(P>0.05).图1 ‘岷县黑裘皮羊’不同组织HSP60 mRNA表达水平Figure 1 The mRNA expression level of HSP60 in different tissues of sheep

2.2 ‘岷县黑裘皮羊’不同组织中HSP60蛋白表达与定位

免疫组织化学染色对‘岷县黑裘皮羊’不同组织中HSP60蛋白进行表达定位研究，结果显示，‘岷县黑裘皮羊’心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉和睾丸组织中均有HSP60阳性表达(图2).其中，在绵羊心肌纤维胞浆、脾脏边缘区、红髓、假复层纤毛柱状上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺脏平滑肌、肾小体周围、近曲小管、远曲小管、精原细胞、初级精母细胞、骨骼肌细胞均有HSP60阳性反应，且着色深浅不一，阴性对照组未见阳性反应.根据积分光密度值比较得出HSP60蛋白的阳性表达量在心脏中最高，肺脏、肾脏、睾丸和肌肉表达量次之，而脾脏表达量最低(图3).

A-C1免疫组化染色(A1、B1、C1为肾脏、睾丸、心脏阴性对照);A.心脏(CC:心肌细胞);B.脾脏 (SN:脾小结 RP：红髓);C.肺脏(PCCE:假复层纤毛柱状上皮 PA:肺动脉);D.肾脏(RC:肾小体 DT:远曲小管 PT:近曲小管);E.睾丸(S:精原细胞 PS:初级精母细胞);F.肌肉(SM:骨骼肌细胞).A-C1 Immunohistochemical staining (A1、B1、C1 as a negative control of testis);A.heart (CC:cardiac cells);B.spleen (SN:splenic corpuscle RP:spleen red pulp);C.lung (PCCE:pseudostratified ciliated columnar epithelium PA:pulmonary artery );D.kidney (RC:renal cortical tubules DT:distal convoluted tubule PT:proximal convoluted tubule);E.testis (S:spermatogonia PS:primary spermatocytes；F.muscle (SM:skeletal muscle cells).图 2 ‘岷县黑裘皮羊’不同组织中HSP60蛋白表达与定位Figure 2 Expression and Immuno-localization analysis of HSP60 in sheep tissues

不同字母表示组间差异极显著(P<0.01)；相同字母表示组间差异不显著(P>0.05).The different letters mean significant difference between the groups(P<0.01);the same letters mean no difference between the groups(P>0.05).图3 绵羊不同组织器官中HSP60阳性反应的积分光密度值Figure 3 Integrated optical density of HSP60 expression in different sheep tissues

2.3 ‘岷县黑裘皮羊’不同组织中HSP60蛋白表达

Western-Blotting结果显示：‘岷县黑裘皮羊’不同组织器官中均可见HSP60蛋白的差异表达(图4-A)，与其它组织相比较，心脏组织中HSP60蛋白

相对表达量最高且差异极显著 (P<0.01)，脾脏表达量最低(图4-B).免疫印迹试验结果与实时荧光定量PCR和免疫组织化学染色检测的结果基本一致，结果均表明HSP60的相对表达量在‘岷县黑裘皮羊’的各组织中存在差异性差异，且心脏组织中表达量最高.

3 讨论

HSP60在细胞周期和细胞程序性死亡等进程中发挥关键作用，但其具体功能和作用机制仍不清楚.目前，已有关于鸡、鼠、人等机体HSP60的报道，但‘岷县黑裘皮羊’HSP60的功能至今未见报道.本研究通过实时荧光定量PCR、免疫组化和Western-Blotting 3种经典方法从基因和蛋白水平探究‘岷县黑裘皮羊’各组织器官中HSP60表达的差异性及规律.结果发现：‘岷县黑裘皮羊’各组织器官中HSP60基因表达存在差异表达，其中心脏中表达量明显高于其他组织，肺脏、肾脏、睾丸和肌肉表达量次之，脾脏表达量最低.据此，推测HSP60在保护心脏完整性发挥关键作用[15.Gullo等[16]表明，HSP60可作为心肌细胞损伤和心力衰竭过程的早期启动器.机体在应激状态下HSP60表达量显著上调，这可能与心脏ATP生成需求增加，心脏收缩率提高等密切相关[17].免疫组化染色发现心肌纤维的胞浆内呈现较明显的HSP60阳性反应，而细胞核内几乎未见其表达，提示HSP60的表达对心肌细胞正常生理活动有重要意义.李士泽等[18]通过Western-blotting检测冷应激后脾脏HSP70的表达变化，结果发现随着冷应激时间延长，脾脏中HSP70的表达持续上调.陈玲等[19]发现急性冷刺激大鼠心肌组织、脾脏和外周血淋巴细胞，在冷刺激初期，心肌组织、淋巴细胞中HSP90蛋白表达明显升高，脾脏在冷刺激初期蛋白表达无明显变化.本试验中，HSP60阳性反应仅发生在红髓和脾脏边缘区，推测HSP60与体液免疫应答相关.Cohen等[20]在豚鼠肺上皮细胞和肺泡巨噬细胞中发现多种HSPs大量表达，提出HSPs在呼吸细胞抵抗逆环境中发挥关键作用.Koh等[21]报道诱导HSPs的高表达，可保护肺脏组织.本试验中，免疫组化的结果显示，‘岷县黑裘皮羊’假复层纤毛柱状上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺脏平滑肌均有HSP60阳性表达，提示HSP60的表达可能与提高肺脏组织抗逆性有关.郭琼梅[22]等研究发现对肾脏进行缺血处理后，HSPs的高表达会减轻缺血再灌注过程中的炎症反应，从而起到保护肾脏的作用.杨洁[23]等发现在过度训练的大鼠肾组织中，HSP70表达量显著上升，且通过免疫组织化学定位发现，皮质表达明显低于髓质.本试验中，免疫组化的结果显示，绵羊肾脏近曲小管、远曲小管、肾小体周围均有阳性表达，推测HSP60对维持血液的酸碱平衡有重要作用.朱晔敏[24]等发现，HSP60在雄性动物的精子发生、精子获能中有积极作用.在精原细胞分化成为精子的过程中，HSP60表达量在有丝分裂期会显著增加[25].本试验中，免疫组化的结果显示，绵羊精原细胞、初级精母细胞中均有HSP60阳性表达，提示HSP60的表达可能与睾丸的生殖功能有关.

A:Western-blotting检测HSP60蛋白在绵羊不同组织器官中的表达,B:绵羊不同组织器官中HSP60蛋白免疫印迹光密度度值,不同字母表示组间差异极显著(P<0.01)；相同字母表示组间差异不显著(P>0.05).A:Western blot assays of HSP60 protein in different tissues and organs of sheep,B:The average optical density of the HSP60 protein in different tissues and organs of sheep,the different letters mean significant difference between the groups(P<0.01);the same letters mean no difference between the groups(P>0.05).图4 绵羊不同组织中HSP60蛋白表达检测Figure 4 The expression level of HSP60 protein in different sheep tissues

本研究证明了HSP60基因在‘岷县黑裘皮羊’各组织器官中存在差异表达，心脏中HSP60基因和蛋白的表达最高.结果表明，HSP60可能对维持心脏或心肌细胞的功能具有重要调节作用，但其具体作用还有待于进一步研究.