藜麦黄酮提取工艺优化

张永花

山西大同大学浑源师范分校， 山西 浑源 037400

0 引言

藜麦(Chenopodiumquinoawilld)，属于藜科，种子形状为圆饼状，直径大小一般在2 mm左右，在其表面有一层水溶性皂角苷[1，2].藜麦含有许多氨基酸，同时它具有调节免疫系统能力，提高人体神经感触与反应能力，对于疾病的预防、癌症的治疗和辅助治疗等有良好作用[3，4].藜麦中含有许多有益于人体的功能物质，如人体必需氨基酸、不饱和脂肪酸、类黄酮、维生素、酚类等多种有益化合物.其中黄酮类物质对于心血管病、病毒预防、肿瘤缓解治疗、自由基清除、免疫调节等方面具有很强的作用.黄酮比维生素E清除氧自由基的能力高出9倍多，不仅可以使细胞保持长期活性，也可以对癌症等疾病的发生起到很强的预防作用，具有良好的医疗保健作用[4，5].因此，人们逐渐开始关注这种物质并进行相关研究.但目前与这个提取工艺有联系的研究报道并不多[6].

本文研究了提取藜麦中黄酮化合物的最佳提取工艺，以更加简便有效地提取黄酮类物质，为藜麦功能性成分的研究开发提供有用参考，为工厂生产黄酮类化合物提供合适的工艺参数指标.

1 实验仪器与材料

(1)实验仪器.101型烘箱，北京凯丰仪器有限公司；HH-2型电热恒温水浴锅、JA2004型电子天平，天津新发现仪器有限公司；UV754N型紫外/可见光分光光度计，苏州威尔仪器有限公司；QE-100型粉碎机，安亭粉碎技术工程有限公司；TDL-5型离心机，北京中兴伟业仪器有限公司.

(2)实验药品.无水乙醇、氢氧化钠，永利化学试剂批发公司；亚硝酸钠、硝酸铝、芦丁，天津市化学试剂批发公司.

(3)实验材料.取自农艺生长状况良好的藜麦品种，购于山西藜谷农业开发有限公司.

2 实验方法

2.1 种子预处理

取适量的藜麦种子于烘箱中充分干燥，去除藜麦中的水分；将失去水分的藜麦种子放入粉碎机中，打开机器工作，一段时间后，失去水分的藜麦变成细小粉末状颗粒，将其经过60目筛进行筛选，取筛选后粉末物质；将筛选后种子装入干燥器皿中保存，以待后续实验.

2.2 总黄酮含量测定

(1)制测待样品溶液，移取样品浸提液放入25 mL的容量瓶中，加入12.5 mL的60 %乙醇溶液，并混匀；分别加入0.75 mL的5 %亚硝酸溶液、0.75 mL的10 %硝酸铝溶液，摇匀后静置15 min；然后加入1.0 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，摇匀并静置15 min；最后用60 %乙醇溶液定容到25 mL.

(2)黄酮提取量的计算，在波长510 nm处测定吸光值并根据标准曲线计算

黄酮提取量=C×V×N/m

式中，C为黄酮浓度，mg/mL；V为材料提取液体积，mL；N为提取液的稀释倍数；m为用于提取的实验材料的质量，g.

2.3 单因素实验

测定黄酮提取率的大小，判断时间、温度、乙醇浓度、料液比对提取效果的影响.所有实验处理均重复3次.

2.4 最佳工艺验证实验

根据实验结果，可知藜麦中黄酮提取工艺中4个因素最佳提取值.但为了得到最佳工艺组合，是否具有可行性，具有实际的操作性，要进行验证.

在最佳条件下，进行提取工艺，这个实验需要重复进行3次，每一次将会得到一个藜麦中的黄酮含量值.采用上述结果进行4因素3水平正交实验，判断该工艺条件是否为最佳工艺条件.

3 实验结果

3.1 标准曲线的绘制

根据上述实验测定，得到标准曲线的回归方程

Y=12.562X-0.002 5R2=0.997 8

式中，X为芦丁标准液浓度，mg/mL；Y为光度值.芦丁标准曲线见图1.

从图1可以看出，在芦丁浓度范围为0 mg/mL～0.09 mg/mL时，吸光度值显示为良好的线性关系，表明实验结果有效，符合实验要求.

3.2 单因素实验

(1)乙醇浓度与总黄酮得率之间的关系.在乙醇浓度的单因素实验中，测得溶液中黄酮含量，计算黄酮得率(图2).

由图2可知，乙醇浓度在40 %～60 %内，藜麦总黄酮的得率与乙醇浓度正相关；在60 %～70 %内，藜麦总黄酮得率有较弱的减少趋势；在70 %～80 %内，藜麦总黄酮的得率与乙醇浓度呈负相关.乙醇浓度为60 %时，总黄酮提取率最大.造成这种结果的原因可能是由于藜麦中含有不同溶解极性的目标化合物，有的容易溶解到水中，有的可以溶解到醇中，因而会造成这样一种现象，溶度不同的乙醇溶液提取藜麦中目标成分得率不同.由此得出，对于藜麦而言，该提取乙醇浓度的最佳范围是50 %～70 %.

(2)浸提温度与总黄酮得率之间的关系.通过对浸提温度的单因素实验，测得溶液中的黄酮化合物含量，计算其得率(图3).

由图3可知，在40 ℃～60 ℃内，藜麦总黄酮得率与温度呈正相关.在60 ℃～80 ℃内，藜麦总黄酮得率与温度呈负相关.主要原因可能是从较低温度开始，温度的增加，为断裂氢键和疏水键，以及克服分子间作用力提供了足够的能量，分子运动增强，因此乙醇的渗透力增强，导致黄酮的提取速率增加[7～9].但对于得率下降的现象，可能温度高出一定值之后，目标产物长期在高温下发生了转化和分解，致使黄酮的提取速率降低.由此得出，对于藜麦而言，最佳提取工艺的温度范围是50 ℃～70 ℃.

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of Rutin图2 乙醇浓度与总黄酮得率的关系Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

(3)浸提时间与总黄酮得率之间的关系.通过对浸提时间的单因素实验，测得溶液中的黄酮化合物含量，计算其得率(图4).

由图4可知，浸提时间在1.5 h时，藜麦中黄酮化合物的提取得率与提取时间呈正相关；在1.5 h～2.5 h时，总黄酮的提取得率与提取时间呈负相关.出现这种结果是因为浸提剂与藜麦中黄酮化合物的完全接触会需要有一定的时间，在起始的一段时间内，显示出得率渐渐升高.但随着处理时间的进一步加强，即时间超过1.5 h后，可能部分不耐高温的黄酮化合物长期在高温条件下发生了转化和分解，致使黄酮的提取速率降低[7].所以，只有在适宜的提取时间下，才能保持较高的浸出率.由此得出，对于藜麦而言，最佳提取时间范围为1 h～2 h.

图3 浸提温度与总黄酮得率之间的关系Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids

图4 浸提时间与总黄酮得率之间的关系Fig.4 Effect of extraction time on the extraction yield of total flavonoids图5 料液比与总黄酮得率之间的关系Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids

(4)料液比与总黄酮得率之间的关系.通过对料液比的单因素实验，测得溶液中的黄酮化合物含量，计算其得率(图5).

由图5可知，在料液比为10 mL/g～30 mL/g时，黄酮的提取速率与料液比呈正相关，黄酮的提取速率在料液比为30 mL/g时达到峰值；料液比大于30 mL/g时，黄酮的提取率降低.原因可能是在10 mL/g～30 mL/g内，藜麦细胞中总黄酮与提取剂浓度差增大，加大了浓度梯度压力，压力越大就为使目标成分不断地向外运动提供了动力，加速了向溶剂中流出，使得率升高.当处于30 mL/g时，藜麦细胞中与乙醇溶剂中目标化合物浓度达到平衡，其溶出速率也不会增加[10,11].所以，只有合适的料液比，才能保证溶出速率达到较高值.因此，最佳料液比范围为30 mL/g～50 mL/g.

3.3 正交实验

正交实验因素与水平见表1，正交实验结果分析见表2.

结果表明，4个因素对藜麦总黄酮提取效果影响顺序为：B

3.4 最佳提取工艺验证

根据最佳提取工艺组合A2B2C3D1提取藜麦中的黄酮，记录黄酮提取量，实验重复3次(表3).

3次验证实验结果均大于正交实验的每一个组合的黄酮提取量，这说明了该工艺条件是最优的提取工艺条件，而且在该工艺条件下，提取的目标产物即黄酮化合物产量稳定，说明了该工艺条件可靠.

表1 正交实验因素与水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交实验结果分析Tab.2 Results analysis of orthogonal test

表3 最佳提取工艺实验验证结果Tab.3 Test results of the optimum extraction process

4 结论

本实验考查的4个工艺因素对藜麦黄酮提取得率均有较大影响，影响程度由高到低的顺序为：料液比>浸提时间>乙醇浓度>浸提温度.

本实验确定的藜麦总黄酮最佳提取工艺条件为60 ℃，60 %乙醇，料液比1∶30，浸提2.0 h.在最佳工艺条件下，黄酮的提取量为2.648 mg/g，说明黄酮类化合物在粮食作物藜麦中的含量丰富，为藜麦中功能性成分黄酮的开发利用提供参考.