炎性小体在结直肠肿瘤中的研究进展

李 冰(综述) 钟芸诗(审校) 周平红

(1复旦大学附属中山医院内镜中心 上海 200032; 2上海消化内镜诊疗工程技术研究中心 上海 200032)

炎症和持续性感染在肿瘤的发生、发展、恶性转化、侵袭、转移等不同阶段都起着关键作用。炎症会诱导包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞在内的免疫应答[1]。炎性小体是近年来新发现的固有免疫系统中的多蛋白复合物,其基本组分是NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)等蛋白质家族作为受体蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)作为接头蛋白、半胱天冬酶-1(caspase-1)作为效应蛋白。由于ASC和caspase-1结构较为固定,而受体蛋白种类复杂,因此以受体蛋白对炎性小体进行分类。此外,经典的炎性小体反应途径主要为,活化的caspase-1促使IL-1β、IL-18等炎性细胞因子成熟,启动炎症相关的细胞程序性死亡,即细胞焦亡(pyroptosis)[2]。此外,组成炎性小体的NLR等不同受体蛋白除可以通过炎性小体的经典反应途径外,也可通过其他非炎性小体途径影响疾病的发生发展。

最新肿瘤发病和致死统计数据显示,结直肠癌作为最常见消化系统恶性肿瘤,其病死率高居全球第2位[3]。同时,包括溃疡性结肠炎和克罗恩病在内的炎性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)已被证实为结直肠癌发病的高危因素[4]。因此,炎性小体作为炎症反应的重要环节,在结直肠癌发生、发展中发挥着重要作用。本文就不同炎性小体在结直肠肿瘤中的作用、相关机制和治疗潜能等研究进展进行归纳总结,另外个别受体蛋白还通过非炎性小体途径进行作用,因此也对这类机制进行了阐述。

NLRP3

NLPR3的结构和激活 NLRP3是目前研究较为深入的炎性小体组成分子。其属于NLR蛋白质家族,由热蛋白结构域(pyrin domain,PYD),核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding and oligomerization domain,NACHT),以及富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats,LRR)组成[5]。NLRP3能够对病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)和损伤相关分子模式(damage associated molecular pattern,DAMP)等炎症反应相关的外源性和内源性信号产生反应,从而启动固有免疫应答[6]。NLRP3炎性小体主要在免疫相关细胞中表达,特别是抗原呈递细胞(antigen-presenting cells,APC)和炎症刺激后大量产生的细胞,如巨噬细胞,树突状细胞,中性粒细胞[7]。关于NLRP3炎性小体的激活,以往研究认为Toll样受体(toll-like receptors,TLR)通过识别PAMP或DAMP产生自身磷酸化并导致核因子-κB(NF-κB)活化,进而刺激NLRP3炎性小体组成分子的转录翻译,及前体IL-1β和前体IL-18的表达[8-9]。此外,胞质内钾、钙离子的转运,溶酶体组织蛋白酶-B的释放会促进非活性的炎性小体及前体IL-1β和IL-18活化、成熟和上调[10-11]。值得注意的是,陈志坚研究组最新研究[12]发现,NLRP3的多种差异极大的激动剂均能引起细胞内的反式高尔基体网络(trans-golgi network,TGN)解体成分散的特殊结构dTGN(dispersed TGN)。dTGN形成以后,其膜上富集的负电磷脂PtdIns4P会招募原本处于细胞质内的NLRP3到dTGN上组装成激活的炎性小体,这一发现从一个新的层面揭示了NLRP3炎性小体激活的机制。

NLRP3与结直肠肿瘤的关系及作用机制 NLRP3炎性小体在结直肠肿瘤发生发展中的研究主要集中于其在结肠炎相关肠癌中的作用机制。虽然炎症通常被认为是针对损伤因素和感染起保护作用的有益反应,但IBD等慢性肠道炎症被认为是结直肠癌发生的危险因素[13]。当使用氧化偶氮甲烷 (azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)结肠癌诱发模型时,由于炎症反应升高和肠上皮屏障遭到破坏,Nlrp3_/_小鼠出现了不典型增生和肿瘤的形成。并且,在炎性小体成分ASC和caspase-1靶向缺失的小鼠中,研究者观察到类似的结果,从而证实了NLRP3炎性小体在抵抗结肠炎相关肿瘤发生过程中起着关键作用[14-15]。进一步对NLRP3炎性小体在结直肠肿瘤发生中的作用机制进行探究,发现在NLRP3和caspase-1缺陷的AOM/DSS结肠癌诱发小鼠模型中,肠道中的IL-18显著降低,而使用重组IL-18可有效阻止肿瘤的发展[15]。此外,经AOM/DSS处理的Il18_/_和Il18r1_/_小鼠相对野生型小鼠也更易发生肠息肉[16]。因此,NLRP3介导IL-18的分泌,可促进肠上皮细胞分化、维持肠上皮完整性并在结肠炎缓解期减少肠上皮细胞的增殖,从而保护结肠炎免于向恶性转化[17]。最近研究发现[18]:NLRP3炎性小体除了可以对抗肠炎相关肠癌的发生,其还可以发挥抑制结直肠癌远处转移的作用;caspase-1缺陷的小鼠更易发生肠癌肝转移,并且正是由于NLRP3的缺失而造成。进一步研究发现,NLRP3炎性小体通过增强IL-18介导的NK细胞杀伤肿瘤细胞的功能,从而抑制肝脏中的肠癌转移灶的生长。

NLRP3与肠道菌群的关系 NLRP3炎性小体与肠道菌群的相关性也在炎性肠病和结直肠肿瘤中逐渐得到证实。Hirota等[19]的研究结果显示,从Nlrp3_/_小鼠中分离的巨噬细胞对细菌胞壁成分酰基二肽表现为无反应,中性粒细胞表现出趋化性降低和自发性细胞凋亡增加。 此外,Nlrp3_/_小鼠表现出结肠β-防御素表达的改变,抗微生物分泌物的减少和肠道独特的菌群类型。而NLRP3炎性小体下游细胞因子IL-1β 和IL-18的缺失也被证实与这种对肠道病原菌的抵抗能力下降有关[20]。当NLRP3炎性小体存在时,其通过直接增强IL-1β的分泌来促进局部抗微生物多肽的分泌,从而使肠道微生物群重塑;同时局部的T细胞也在维持肠道稳态,对抗其他有害的肠道炎症中发挥着重要作用,表现出对结肠炎和结直肠肿瘤很强的抵抗能力[21]。但是,目前仍需要进一步的研究工作来阐明肠道菌群与NLRP3炎性小体在肠道炎症及结直肠癌中相互作用的信号转导途径。

NLRP3的促癌作用 在其他研究中,与报道的NLRP3具有抵抗结直肠肿瘤发生发展功能相反的是:DSS诱导性肠炎在Nlrp3_/_小鼠中却表现出减弱,并且暴露于DSS时加用caspase-1抑制剂治疗可改善结肠炎;这可能因为促炎细胞因子IL-1β、NF-α和IFN-γ的局部减少[22]。NLRP3炎性小体的促癌功能也表现在:巨噬细胞通过NLRP3炎性小体与肿瘤细胞进行细胞间相互作用而增强结直肠癌的侵袭和转移能力,这可能为结直肠癌发生肝转移的机制之一[23]。因此,NLRP3炎性小体在结直肠肿瘤发生发展过程中的作用仍存在一定争议,需要进一步研究来解释其功能的多样性。

NLRP6NLRP6与NLRP3同属于NLR家族,具有相似的分子结构。目前对于NLRP6炎性小体的研究集中于其在肠道上皮中的保护作用。与NLRP3相似的是,在AOM/DSS结肠癌诱发模型中,NLRP6缺失型小鼠结肠炎和结肠炎相关性肿瘤的易感性增加[24]。NLRP6可促进caspase-1的激活,增加IL-18的产生,与NLRP3相似。而NLRP6及下游IL8会影响肠道微生物菌群组成结构,NLRP6基因表达缺失可导致肠道的炎症普雷沃氏菌(Prevotellaceae)和 TM7细菌数量增加,加重结肠炎症[25]。进一步研究表明,NLRP6炎性小体不仅通过IL-18在上皮细胞中调节包括血管生成素-4,内凝集素-1(intelectin-1)和抵抗素样β分子在内的抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)的转录[26],而且也间接下调了IL-22结合蛋白(IL-22BP)的表达,使得IL-22升高以诱导上皮抗菌反应,从而调控结直肠肿瘤的发生。Muc2黏蛋白是NLRP6炎性小体发挥作用的另一效应蛋白,是由杯状细胞产生的大分子糖蛋白,其构成了固有防御系统的第一道防线。Muc2缺失的小鼠会出现自发性结肠炎,且无法在黏膜表面阻止和清除黏附的病原体[27]。NLRP6炎性小体对Muc2的分泌起到关键的调节作用,其缺乏会导致杯状细胞无法通过分泌黏液而将细菌排出[28],从而影响肠炎和肠炎相关性肿瘤的发生。

AIM2

AIM2的炎性小体途径 黑色素瘤缺乏因子(absent in melanoma 2,AIM2)是一种细胞内DNA感受器,能够感受到DNA病毒或细菌感染时释放到细胞质的dsDNA,募集ASC后进而激活caspase-l,促进炎性细胞因子成熟与分泌,形成经典的炎性小体反应[29]。临床研究已经发现AIM2的表达与结直肠癌分级呈负相关,其表达缺失与结直肠癌患者的预后不良( 生存时间短、复发率高、转移率高) 密切相关,可能成为指示患者预后的标志物之一[30]。而关于AIM2在肿瘤中深入的机制探索,除了上述的炎性小体经典反应途径,目前还有研究集中于不依赖炎性小体的方式。

AIM2非炎性小体依赖途径 Wilson研究团队[31]观察到Aim2基因缺陷AOM/DSS诱导结直肠癌小鼠模型中出现了比Asc缺陷小鼠更大的肿瘤负荷,Aim2_/_/ApcMin/+的肿瘤负荷也高于ApcMin/+小鼠。进一步研究发现AIM2的作用不依赖于炎性小体激活和IL-1β,而是AIM2与DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)相互作用并限制其活化。而AIM2的缺失会促进DNA-PK介导的Akt过度活化,从而促进细胞增殖和减少细胞凋亡,导致癌症的发生。此外,Man等[32]研究也发现Aim2缺陷型小鼠结肠肿瘤易感性增加,炎性小体相关细胞因子和其他炎症介质的产生无显著改变。他们指出,这种情况下肿瘤的发生是由于肠道干细胞发生了不可控增殖,异常Wnt信号转导在没有AIM2的情况下增强了干细胞向肿瘤发育的能力[32]。此外,他们还发现Aim2缺陷型小鼠在与野生型小鼠合养发生肠道菌群互换后,合养的AIM2缺陷小鼠比分开饲养的AIM2缺陷小鼠在结肠肿瘤的发生率和数量上明显下降。揭示了结直肠肿瘤发生可能受到宿主遗传因素和肠道微生物群共同调控,AIM2表达和有益的肠道微生物群具有预防结直肠肿瘤的潜力。

NLRP1,NLRP12和NLRC4

NLRP1的抑制肿瘤作用 NLRP1炎性小体虽然在各类中首先被描述,但其在人结直肠肿瘤中的研究目前还不够深入。在动物模型中,Nlrp1b_/_小鼠与野生型小鼠相比,肠道炎症加重,肿瘤易感性增加,IL-1β和IL-18 水平降低;而在恢复肠道中NLRP1表达后,小鼠肠道肿瘤的生长得到抑制,生存期延长,表明肠道上皮细胞中 NLRP1可通过经典途径抑制肠道肿瘤形成[33-34]。

NLRP12与结直肠肿瘤 NLRP12可介导经典炎性小体反应,产生IL-1β 和IL-18,但目前对于其在肠道炎症及肿瘤中的研究集中于不依赖炎性小体的抗炎抑癌作用。在Nlrp12基因缺陷小鼠中,炎性细胞因子、趋化因子和致癌因子的产生增多,结肠炎症和肿瘤易感性增加,这可能与NLRP12抑制巨噬细胞中的NF-κB和ERK活化的功能缺失相关[35]。进一步研究发现,NLRP12通过与肿瘤坏死因子受体相关因子3(TNF receptor-associated factor 3,TRAF3)和NF-κB 诱导激酶(NF-κB inducing kinase,NIK)的相互作用负性调控非经典NF-κB信号通路,从而调控肠道炎症和肿瘤的发生发展[36]。

NLRC4的肠道保护作用 NLRC4同样在肠道中发挥着保护作用。NLRC4炎性小体在肠道的吞噬细胞中促进成熟IL-1β产生,通过特异性反应清除病原体,保护肠道[37]。其可通过下游caspase-1调节上皮细胞修复损伤,预防结肠炎相关的肿瘤的形成[38]。

炎性小体与治疗干预对炎性小体在肠道炎症及肿瘤中作用和机制的研究为相关疾病提供了治疗途径。以往已经出现针对炎性小体产物IL-1β和IL-18的药物,如中和IL-1β的卡纳单抗及IL-18结合蛋白用于治疗炎症相关疾病,而直接作用炎性小体的产生有可能获得更好的治疗效果。

NLRP3作为研究较为深入的类型,为治疗途径的首选靶标。新型小分子特异性抑制剂,如MCC950和CY-09已被用于靶向抑制NLRP3激活,并在治疗多种炎症性疾病中发挥作用[39-40]。近期一项在小鼠模型中的研究使用MCC950治疗IBD,在喂服3周后,疾病症状得到明显改善[41]。与抑制caspase-1或阻断IL-1β受体相比,使用另一NLRP3抑制剂INF39在减轻肠道炎症性改变方面取得更好的效果,揭示了NLRP3抑制剂在肠道炎症中的应用价值[42]。另外一项关于穿心莲内酯(Andrographolide)的研究表明,其通过诱导巨噬细胞中的线粒体自噬,可使NLRP3炎性小体失活,从而在小鼠模型中阻止结肠癌的发生[43]。相似的是,AMPK激活剂GL-V9通过触发细胞中的自噬分解NLRP3炎性小体可以治疗结肠炎并且预防结肠炎相关肿瘤的发生[44]。目前,各种药物虽在动物模型中取得一定成效,但距离临床应用还有距离。

结语我们将NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、NLRP12和AIM2调控炎性肠病及结直肠肿瘤发生发展的途径归纳如下:(1)通过形成的炎性小体改变IL-1β和IL-18等细胞因子分泌而直接影响细胞增殖与凋亡;(2)调节肠道菌群平衡;(3)影响非炎性小体依赖的信号通路。由此反映出各类炎性小体发挥作用的机制有相似之处,又有各自独特的途径,且同一种炎性小体在结直肠肿瘤中也存在着促进和抑制肿瘤发生的不同表型。

此外,针对炎性小体的药物虽在体外和动物模型中正逐步得到开发应用,但我们不禁思考如何开发出直接针对炎性小体成分的药物用于结直肠肿瘤的预防和治疗,而不是针对IL-1β等效应分子;针对炎性小体这一固有免疫系统成分的干预,是否会影响到适应性免疫反应？因为炎症的发生本身就具有两面性,如何平衡药物对炎性小体抑制后对人体的利与弊？随着对炎性小体在包括结直肠肿瘤在内的各类疾病中的不断深入研究,期望能开发出可被临床应用的相关新药和治疗方法。