KLF4对胰腺癌上皮间质转化和侵袭能力的影响

徐向辉 赵忠 赵国栋 盛金鑫

江苏省海门市人民医院普外科，海门 226100

Krǜppel样因子4(Krǜppel-like factor4, KLF4)是一种锌指结构转录因子，在C端包含3个连续的C2H2结构域[1]，能够调控多种癌基因、抑癌基因的信号通路，在肿瘤增殖、侵袭和转移等多种病理过程中发挥作用[2-3]。研究表明KLF4在食管癌、结直肠癌、胃癌等肿瘤中发挥抑癌基因的作用[4-6]，而在乳腺癌、前列腺癌等肿瘤中发挥癌基因的作用[7-8]。KLF4在胰腺癌中的作用尚不十分明确。上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，已被证实在恶性肿瘤侵袭、转移中起重要作用[9-10]。Li等[11]报道，肝癌组织表达的KLF4能够直接抑制slug、Zeb1等因子的表达，进而抑制EMT和肝癌的侵袭、转移。本研究通过下调胰腺癌细胞PANC1 KLF4的表达，探讨其在胰腺癌EMT和侵袭中的作用。

材料与方法

一、胰腺组织KLF4表达检测

胰腺癌组织芯片购于美国BioMax公司，包含胰腺癌组织70例和10例匹配的胰腺正常组织。采用免疫组织化学染色法检测芯片中组织的KLF4蛋白表达。兔抗人KLF4多克隆抗体及鼠抗兔IgG均购于美国Santa Cruz公司。最后DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片，由2位副高职病理科医师显微镜下阅片并评分。染色强度：无染色为0分，浅棕色为1分，棕色为2分，深棕色为3分；阳性细胞百分比：<10%为0分，10%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分；两得分相乘，≤3分为阴性，3～≤6分为弱阳性，>6分为强阳性。

二、细胞培养和质粒构建及转染

胰腺癌细胞PANC1购于中国科学院细胞库(上海)，常规培养传代。设计针对KLF4的小发卡RNA(shKLF4)：正义链为5′-GACCAGGCACUACCGUAAAdTdT-3′，反义链为3′-dTdTCUGGUCCGUGAUGGCAUUU-5′。引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。采用酶切法将引物插入质粒pGL-4.27，采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)将重组质粒转染对数生长期PANC1细胞，为shKLF4组，以转染阴性对照质粒的细胞为阴性对照组，未转染质粒的细胞为空白对照(mock)组。

三、KLF4、E-cadherin、vimentin mRNA表达检测

收集对数生长期PANC1细胞，采用Trizol(Invitrogen公司)提取细胞总RNA。采用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒(日本TaKaRa公司)将总RNA逆转录为cDNA，反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。采用SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) 试剂盒(日本TaKaRa公司)进行实时荧光定量PCR，反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40次循环。由仪器自带软件获取Ct值，按公式2-△△CT计算目的基因mRNA表达量。

四、KLF4、E-cadherin、vimentin蛋白表达检测

收集对数生长期PANC1细胞，加适量RIPA和蛋白酶抑制剂PMSF置于冰上裂解30 min，离心取上清。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)定量蛋白的浓度后取30 μg常规行蛋白质印迹法检测蛋白表达，以GAPDH作为内参。抗KLF4、E-cadherin、vimentin抗体均购于美国Santa Cruz公司，最后ECL发光，X片曝光、显影、定影。采用凝胶图像软件分析系统扫描。采用Image J软件分析扫描图像,以目的基因条带与内参条带的灰度值比为蛋白相对表达量。

五、细胞迁移能力检测

先将6孔板底部用标记笔划3条水平线作为拍照标记，然后取对数生长期细胞接种于6孔板，每孔1×106个细胞，每组设3个复孔。待细胞融合度达到90%时弃去培养基，用20 μl枪头在孔中间垂直于水平线划一条横线，PBS冲洗后加无血清DMEM培养基2 ml。于划线后即刻和培养16 h时分别拍照并观察各组细胞横向迁移距离。划线后0 h划痕宽度设为A，12 h划痕宽度设为B，A-B/A×100%则为划痕愈合百分比。

六、细胞侵袭和转移能力检测

采用美国Corning公司的带有8 μm小孔的Transwell小室及美国BD公司的Matrigel基质胶检测。侵袭实验前先将Matrigel基质胶置于4℃过夜融化，第二天将融化的基质胶用无血清DMEM培养基稀释6倍(冰上操作)，从上室加入100 μl此混合液，37℃孵育4 h后使用。取对数生长期细胞200 μl(20 000个细胞)铺于上室，下室加600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养16 h后取出小室，PBS洗3遍后用棉签擦去上室未穿膜细胞，用4%多聚甲醛固定20 min，然后用结晶紫染色30 min，晾干后置于显微镜下，每个小室随机取5个视野并计数穿膜细胞数，取均值。

七、统计学方法

结 果

一、胰腺癌和正常胰腺组织KLF4的表达

KLF4表达在细胞质和细胞核(图1)。胰腺癌组织的阳性表达率为47.1%，正常胰腺组织阳性表达率为80.0%。KLF4表达与胰腺癌分化、病理分期和远处转移呈负相关(表1)。

图1 胰腺组织中KLF4阴性(1A)、弱阳性(1B)、强阳性(1C)表达

表1胰腺癌组织KLF4表达与临床病理特征的关系[例(%)]

变量例数KLF4表达阴性弱阳性强阳性χ2值P值年龄(岁) <4582(25.0)3(37.5)3(37.5)1.30.5 ≥456218(29.0)32(51.6)12(19.3)性别 男4511(29.0)24(53.3)10(22.2)5.10.08 女2512(48.0)7(28.0)6(24.0)肿瘤分化 Ⅰ期和Ⅱ期5120(39.2)19(37.3)12(23.5)12.800.002 Ⅲ期1915(78.9)4(21.1)0UICC分期 Ⅰ期和Ⅱ期6131(50.8)19(31.1)11(18.1)6.140.047 Ⅲ期和Ⅳ期97(77.8)2(22.2)0远处转移 有33(100.0)0073.10.000 无6734(52.2)21(31.3)12(16.5)

二、KLF4、E-cadherin、vimentin基因表达的变化

mock组、对照组、shKLF4组PANC1细胞的KLF4 mRNA和蛋白表达量分别为1.01±0.18、1.02±0.20、0.22±0.06和1.01±0.08、1.20±0.16、0.24±0.02；上皮型标志物E-cadherin mRNA和蛋白表达量为1.01±0.18、1.03±0.19、0.20±0.10和0.96±0.11、1.26±0.11、0.36±0.06；间质型标志物vimentin mRNA及蛋白表达量为1.00±0.15、1.01±0.14、2.91±0.21和0.12±0.05、0.08±0.02、1.18±0.18。shKLF4组的KLF4基因表达显著下调(F=24.95，P=0.0012；F=77.37，P<0.0001)，E-cadherin基因表达也显著下调(F=25.71，P=0.0011；F=67.99，P<0.0001)，而vimentin基因表达显著上调(F=126.30，P<0.0001；F=99.23，P<0.0001，图2)，差异均有统计学意义。mock组与对照组的差异均无统计学意义。PANC1细胞形态也由上皮型向间质型发生转变(图3)。

图2 mock组(1)、对照组(2)、shKLF4组(3)PANC1细胞的KLF4、E-cadherin、vimentin蛋白表达

图3 mock组(3A)、对照组(3B)、shKLF4组(3C)PANC1细胞的形态变化

三、PANC1细胞迁移和侵袭能力的变化

mock组、对照组、shKLF4组细胞的划痕愈合能力分别为(11±2)%、(10±1)%、(21±3)%；迁移实验的穿膜细胞数为(96±13)、(88±12)、(215±23)个细胞/40倍视野；侵袭实验的穿膜细胞数为(101±14)、(92±13)、(179±18)个细胞/40倍视野。shKLF4组细胞的划痕愈合(F=47.82，P<0.001，图4)、迁移(F=53.68，P=0.0001，图5)和侵袭(F=27.65，P=0.0009，图6)能力均显著增强，差异均有统计学意义，而mock组与对照组的差异均无统计学意义。

图4 mock组(4A、4B)、对照组(4C、4D)、shKLF4组(4E、4F)PANC1细胞的划痕愈合能力

讨 论

KLF4是一种锌指结构转录因子，在多种肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因的作用[12-13]。KLF4在胃癌中通过转录抑制β-catenin的表达而抑制胃癌细胞生长增殖、侵袭和转移能力[14]。在结肠癌中KLF4的表达较结肠正常组织表达明显下降，且KLF4表达量越高，结肠癌复发率越低、生存期越长[15]。已有研究表明，KLF4在黑色素瘤和前列腺癌中发挥促癌的作用。Shi等[16]研究表明KLF4在胰腺癌中表达降低，且通过抑制KLF4的表达降低胰腺癌细胞侵袭转移能力。Guo等[17]亦发现KLF4在胰腺癌中通过抑制MSI2的表达降低胰腺癌细胞生长和转移能力。本研究分析了KLF4在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达，并探索KLF4对胰腺癌EMT和侵袭转移能力的影响。结果显示KLF4在胰腺癌组织中表达量明显低于胰腺正常组织；KLF4表达与肿瘤分化、病理分期和远处转移呈负相关；下调KLF4表达后胰腺癌体外侵袭转移能力增强。本研究结果表明KLF4在胰腺癌中发挥抑癌作用，能够抑制胰腺癌细胞体外侵袭能力。

众所周知，EMT在肿瘤的恶性转化、侵袭和转移中发挥重要作用[18]。已有研究发现多种因子参与肿瘤EMT的调控，如Smad4、Cav-1、ZEB-1等。然而，关于KLF4在胰腺癌EMT和侵袭中的作用尚未明确。本研究发现，下调PANC1细胞中KLF4的表达后，EMT上皮型标志物E-cadherin的mRNA和蛋白水平均降低，而间质型标志物vimentin的mRNA和蛋白水平均升高，且PANC1细胞形态由上皮型向间质型发生转变。表明KLF4能够通过促进E-cadherin的表达和抑制vimentin的表达而抑制EMT发生。最近，亦有报道称KLF4能够通过转录激活肝细胞核因子-6的表达而抑制肝癌的侵袭和转移[19]。此外，KLF4的表达也能够被多种非编码RNA调控，如miR-32[20]、miR-152[21]等。因此，KLF4在胰腺癌中发挥抑癌作用的调控机制及各因子之间的相互作用还有待于深入研究。

图5 mock组(5A)、对照组(5B)、shKLF4组(5C)PANC1细胞的迁移能力 图6 mock组(6A)、对照组(6B)、shKLF4组(6C)PANC1细胞的侵袭能力

综上所述，KLF4在胰腺癌进展中发挥抑癌作用，通过抑制EMT而降低胰腺癌细胞体外侵袭能力，靶向调控KLF4表达可能为胰腺癌防治提供新的思路。

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