南方红豆杉水提物通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控HER2阳性胃癌移植瘤生长实验研究

池苗苗 王亚坤 谢长生

胃癌是常见恶性肿瘤之一。抗人类表皮生长因子受体2（HER2）单克隆抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab，商品名：赫赛汀，Herceptin）对 HER2 阳性胃癌有明显的临床意义。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路的异常激活对胃癌的发生起着重要的作用[1]，可受HER2调控，活化的AKT又可激活下游的雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），研究表明，PI3K/AKT/mTOR信号传导通路异常激活后，可发生肿瘤疾病，并与细胞增殖和凋亡相关[2]。南方红豆杉（taxus chinensis var.mairei）具有较高的抗肿瘤作用。本实验通过建立人胃癌HER2阳性移植瘤模型裸鼠，研究南方红豆杉水提物对PI3K/AKT信号通路相关靶点的作用，并从mRNA及蛋白表达水平对其机制进行初步探讨，为临床用药提供依据。

1 实验材料

1.1 动物与瘤株 4～6周龄BALB/c裸鼠80只，体质量18～20g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号：[SCXK（沪）2013-0016]。人胃癌HER2阳性细胞株NCI-N87购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 药物与试剂 南方红豆杉购自宁波泰康红豆杉生物工程有限公司（规格：8g/袋，批号 100513）。曲妥珠单抗：购自上海罗氏公司（规格：440mg/瓶，批号N3586）。GIBCO胎牛血清购自美国GIBCO公司，RPMI-1640培养液购自吉诺生物医药技术有限公司。

1.3 主要仪器 蛋白印迹检测系统由美国Bio-Rad公司生产，多功能全波长酶标仪系统由美国Thermo公司生产，定量PCR仪器由美国ABI公司生产。

2 实验方法

2.1 南方红豆杉水提物制备 取13袋南方红豆杉（8g/袋）置于医用不锈钢锅中，冷水中充分浸泡过夜，置入控温电炉，第一遍时加入药物7倍量的冷水煮沸20min，煮沸后倒出药液，第二遍时加入药物5倍量的煮沸20min，倒出药液，合并两次煎液，旋转蒸发仪浓缩至终浓度为208mg（生药量）/mL，静置过夜后用滤网过滤药渣，将过滤液作为高剂量母液，按照1：2和1：4体积分别稀释为中剂量104mg（生药量）/mL和低剂量52mg（生药量）/mL，药物保存在4℃冷藏冰柜。

2.2 赫赛汀溶液制备 用20mL灭菌注射用水配制成无色至淡黄色的透明液体作为母液，母液浓度为21mg/mL，4℃冰箱保存。

2.3 细胞培养 用含有10%胎牛血清的RMPI-1640培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件培养箱内培养，1～2天更换1次培养液，待细胞长满培养瓶后，加2mL 0.25%胰酶-EDTA消化，置于培养箱10～15min，待细胞全部脱落加培养基终止消化，将细胞悬液移至离心管，800rpm离心5min，弃上清液，重悬于细胞培养液中按1:2比例进行传代，每3～5天传代1次。

2.4 建立模型、分组给药 取1×107个/mL的NCIN87单细胞悬液接种裸鼠右侧腋窝下，接种后第七天观察瘤体情况并将80只BALB/c裸鼠采用随机数字表法随机分为对照组、红豆杉高剂量组、红豆杉中剂量组、红豆杉低剂量组、赫赛汀（Herceptin）联合红豆杉（高、中、低）剂量组，Herceptin单药组，共8组，每组10只。实验中共有4只裸鼠死亡，从相应组别中剔除。根据《中药药理研究方法学》计算，红豆杉低、中、高剂量分别为：成人剂量的 5 倍（0.520g·kg-1·d-1），成人剂量的 10 倍（1.040g·kg-1·d-1），成人剂量的20 倍（2.080g·kg-1·d-1），灌胃，共给药 3 周。根据前期实验及参考文献[3]，Herceptin组首剂按40mg/kg腹腔注射给药，每7天1次，后2次按20mg/kg给药，共给药3次。联合组同时灌胃给药，每次3mL，共给药3周。接种后第28天取瘤用于检测。

2.5 Western Blot检测蛋白表达 取适量瘤组织加入RIPA裂解液（含PMSF），进行匀浆再置于冰上。裂解30min后进行4℃下12000r/min离心5min，提取蛋白。用BCA法进行蛋白浓度测定，等量上样；然后进行SDS-PAGE电泳；最后用Quantity one图像分析软件进行灰度值分析。

2.6 实时荧光定量PCR检测基因表达 取移植瘤组织约50mg进行组织总RNA提取和纯化，进行RNA浓度测定，OD260/OD280为1.8～2.2之间。引物设计及合成由上海生工公司提供。PI3K（p110α）mRNA上游引物序列为：5’-ACACCACGGTTTGGAC TATGG-3’，下游引物序列为：5’-GGCTACAGTAGT GGGCTTGG-3’，AKT1 mRNA 上游引物为：5’-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3’，下游引物为：5’-TT GTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3’，mTOR mRNA 上游引物为：5’-ACCGGCACACATTTGAAGAAG-3’，下游引物为：5’-CTCGTTGAGGATCAGCAAGG-3’。

各组裸鼠移植瘤组织总RNA提取和cDNA合成按试剂说明书操作。使用ABI荧光定量PCR仪器进行，每个样品取2μL作为模板。反应体系：上下游引物各 0.4μL，DNA 样品 2μL，ddH2O6.8μL，SYBR Premix Ex TapTM10.0μL。PCR循环结束后，样品加热到95℃马上降至60℃并保持15s，然后按照1.75℃·s-1递增到95℃，在升温时收集荧光信号，建立熔解曲线。

2.7 统计学方法 应用SPSS22.0统计分析软件进行处理，数据均以平均数±标准差（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA），方差齐性采用 LSD 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 Western Blot检测各组瘤组织 PI3K、pAKT、mTOR蛋白表达 应用Quantity one软件分析并与β-actin灰度值比值显示结果（见表1、插页图1）。与对照组比较（插页图1-1），红豆杉中、低剂量组PI3K蛋白相对表达量均极显著降低（P＜0.01）；与赫赛汀组（Herceptin）比较，红豆杉中剂量联合赫赛汀组PI3K蛋白相对表达量显著降低（P＜0.05）；红豆杉中剂量联合赫赛汀组PI3K蛋白相对表达量较红豆杉高、低剂量联合组显著降低（P＜0.05）。与对照组比较（插页图1-2），红豆杉单药组pAKT蛋白表达相对量差异无统计学意义（P＞0.05）；红豆杉高剂量组较红豆杉中、低剂量组pAKT蛋白表达相对量显著降低（P＜0.05）；与对照组比较，红豆杉联合赫赛汀组pAKT 蛋白相对表达量均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），红豆杉联合组组间差异不显著（P＞0.05）。与对照组比较（插页图1-3），红豆杉各组mTOR蛋白表达显著下调（P＜0.05，P＜0.01）；红豆杉单药各组红豆杉高、低剂量组mTOR蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与对照组比较，红豆杉各剂量联合赫赛汀组及赫赛汀组mTOR蛋白表达极显著降低（P＜0.01）。与赫赛汀组比较，红豆杉高剂量联合赫赛汀组OTOR蛋白表达量显著降低（P＜0.05），红豆杉联合赫赛汀各组间差异不显著（P＞0.05）。

图1 各实验组PI3K、pAKT、mTOR蛋白表达

图2-1 PI3K mRNA扩增曲线图

图2-3 AKT1 mRNA扩增曲线图

图2-5 mTOR mRNA扩增曲线图

图2-2 PI3K mRNA溶解曲线图

图2-4 AKT1 mRNA溶解曲线图图2 各组PI3K、APT1、mTOR mRNA表达

图2-6 mTOR mRNA溶解曲线图

3.2 实时荧光定量PCR法检测各组瘤组织PI3K、AKT1、mTOR mRNA表达 结果显示，与对照组比较，红豆杉低剂量组PI3K mRNA表达降低（P＜0.05），红豆杉联合组及赫赛汀组PI3K mRNA表达显著降低（P均＜0.01）。与赫赛汀组比较，红豆杉高、中、低剂量联合赫赛汀组PI3K mRNA表达显著降低（P＜0.01或P＜0.05），与对照组比较，红豆杉单药组AKT1 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）；红豆杉高、中剂量组AKT1 mRNA表达较红豆杉低剂量组显著降低（P＜0.05）；红豆杉高、中、低联合赫赛汀组 AKT1 mRNA表达显著降低（P＜0.01）。与赫赛汀组比较，红豆杉联合赫赛汀各组AKT1 mRNA表达差异不显著（P＞0.05）；红豆杉联合组组间差异不显著（P＞0.05）。与对照组比较，红豆杉中、低剂量组mTOR mRNA 表达显著降低（P＜0.05），红豆杉联合赫赛汀各剂量组及赫赛汀组mTOR mRNA表达显著降低（P＜0.01）。与赫赛汀组比较，红豆杉联合赫赛汀各组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。

表1 各组瘤组织PI3K、pAKT、mTOR蛋白表达量比较（x±s）

表2 各组瘤组织PI3K、AKT1、mTOR mRNA表达量比较（x±s）

4 讨论

HER2属于表皮生长因子受体（EGFR）家族，是一种原癌基因，与多种恶性肿瘤的发生发展及预后有密切联系[4]。其中曲妥珠单抗是重组的人源化抗HER2的单克隆抗体，通过抑制HER2参与的信号传导[5-6]，发挥抑制肿瘤细胞生长的作用，并且可以在HER2高表达的NCI-N87胃癌细胞内诱发抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）效应而杀伤靶细胞[7-8]，从而增强抗肿瘤活性。PI3K/AKT/mTOR信号通路激活可受HER2调控，HER2通过活化PI3K，催化第二信使 3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3），在 PDK1和mTORC2作用下激活下游的AKT，调节细胞抗凋亡[9-10]。活化的AKT进一步激活下游因子，如mTOR，调节细胞周期、凋亡和新生血管生成。AKT的三个亚型有80%以上的氨基酸序列同源性，相似的结构，存在共同结构特征于三个不同的功能区域，三个亚型均参与下游底物的活化[11]，其中AKT1促进细胞存活和增殖并在，并在肿瘤的发生、细胞生长、增殖过程中起重要作用。PI3K/AKT/mTOR信号通路的阻断，可以通过抑制此信号通路上的各个靶点，例如siRNA靶向阻断I型PI3K，从而阻断PI3K信号通路，导致肿瘤细胞的凋亡[12]。另外，通过抑制AKT的激活，从而进一步抑制下游信号靶点的激活导致信号通路的阻断[13-14]，抑制肿瘤细胞的增殖。

本实验结果表明，不同剂量南方红豆杉水提物能部分下调PI3K、pAKT、mTOR表达，中、低剂量组下调PI3K、mTOR表达较高剂量组明显，高剂量组下调pAKT较中、低剂量组明显，起到抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而抑制肿瘤的生长，但不同剂量南方红豆杉水提物对相同靶点的作用结果存在着差异，且红豆杉联合赫赛汀后较红豆杉单药组下调各靶点的表达更显著，这些差异提示虽然部分抑制了此信号通路的激活，HER2阳性胃癌仍可以通过其他信号通路起到增殖作用。从而得出南方红豆杉水提物能通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制HER2阳性胃癌移植瘤生长，也可能存在作用于除PI3K/AKT/mTOR信号通路外其他旁路或下游通路等从而抑制HER2阳性胃癌的发展。