新型免疫增强剂CpG ODN的研究进展

徐 宁，杜 锐，李健明，时 坤，宫庆龙，孙志博，郜艳雪，栾美慧，冷 雪*，周 宇

(1.吉林农业大学，吉林长春 130118；2.惠州海关，广东惠州 516006)

由于近年来CpG ODN在某些感染性疾病、过敏性疾病和肿瘤等的防治中显现出的良好效果，越来越多的学者开始致力于对其的研究。近几年国外对于CpG ODN在感染性疾病及肿瘤中的佐剂作用的研究已进入Ⅰ/Ⅱ 期临床试验阶段，并已证实其作为新型免疫佐剂与常规佐剂相比具有高效、低毒的优势。笔者主要通过查阅近年来与CpG ODN的免疫调节机制、作为免疫增强剂的作用以及安全性研究相关的国内外文献，进行归纳总结，以期为CpG ODN作为新型佐剂的研究和应用提供参考。

1 CpG ODN的分类和结构

CpG ODN是一类含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸链，呈单链DNA形式，含有1个或多个非甲基化的CpG基序，由于具有良好的促进免疫应答的效果而常在临床研究中被用作免疫增强剂。基于CpG ODN结构上的不同及其诱导的免疫反应性质的差异，在人体中已经鉴定出3类不同的CpG ODN，尽管每类CpG ODN都包含至少一个由中央未甲基化CG二核苷酸加上结合区域组成的基序，但它们在结构和免疫学活性方面却不尽相同。B型ODN通常在硫代磷酸酯骨架内包含有1～5个CpG基序，这种骨架增强了其对核酸酶消化的抵抗力，并且显著延长了体内半衰期(30～60 min，而磷酸二酯为5～10 min)，B型ODN具有诱导pDC分化的能力，在产生TNF-α的同时也刺激B细胞增殖和分泌IgM，是B细胞的强活化剂，但是在诱导IFN-α产生和激活NK细胞方面的能力较弱[1-2]。与B型CpG ODN不同的是，A型CpG ODN可诱导高水平的IFN-α产生，并且引起明显的NK细胞活化。A型CpG ODN具有两侧被硫代磷酸酯末端核苷酸修饰的磷酸二酯核，因其两侧携带的单个CpG基序呈回文结构，所以能够形成茎环结构。B型CpG ODN与A型CpG ODN的活性不同很大程度上是因为二者的CpG /TLR9复合物在pDC核内体的保留时间不同，B型ODN可通过早期核内体快速转运至晚期核内体，但A型ODN却可在早期核内体中保留较长时间[3-4]。A型ODN与MyD88/IRF-7复合物在早期核内体中相互作用，触发能够诱导干扰素(IFN)产生的信号级联反应[4]。由于 poly-G尾部之间的相互作用，A 型ODN在溶液中更倾向于形成复杂的多聚体，但是A型ODN这一特性却成为其应用于临床试验的障碍，近年来为了解决这个问题，通常把A型ODN包装成稳定的病毒样颗粒(VLP)，以便它在临床研究中能充分发挥其佐剂作用[5-6]。C型ODN在完全由硫代磷酸核苷酸组成方面与B型ODN类似，在含有可形成茎环结构或二聚体的回文CpG基序方面与A型ODN类似，这类ODN在刺激B细胞分泌IL-6的同时也刺激pDC产生IFN，由于在早期和晚期核内体中均有活性，所以C型ODN可以表达B型和A型ODN所共有的特性[7-8]。C型ODN具有中等免疫效应以及独特的结构特征，在体内具备良好的稳定性。由于含有双重回文序列，所以C型 CpG ODN在其富含GC的3′末端可以形成发夹结构，又由于存在5′回文序列而可以进行串联，这些高度有序的结构能够诱导任何类型的CpG ODN产生I型IFN[9]。每种ODN具体的结构特点、功能等如表1所示。

2 CpG ODN的免疫调节机制

Toll 样受体(Toll-like receptors，TLRs)是免疫调节中一种非常重要的蛋白质分子，作为一种信号转导型抗原识别受体，既可以参与固有免疫，又可以识别适应性免疫和固有免疫之间的关系，为开发新型疫苗佐剂或免疫增强剂奠定基础[10]。

表1 CpG ODN的分类及结构特点

TLR9是TLRs家族成员之一，主要识别细菌DNA的CpG基序。CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)是人工合成的含有非甲基化的CpG的ODN，能以TLR9依赖的方式刺激机体固有免疫应答，通常用于TLR9的研究[11]。病毒和细菌基因组中的CpG-DNA是TLR9的天然激动剂，所以一旦细胞感染或摄取细菌，TLR9就会启动Th1型优势免疫应答[12-13]。TLR9分子在不同物种之间存在差异，人体与小鼠中TLR9的结构相差24%[14]；在细胞类型表达方面，物种之间也存在差异：例如，TLR9受体存在于啮齿动物中，但不存在于原始巨噬细胞和髓样树突细胞(mDC)中。在人体中，TLR9主要由浆细胞样CD(pDC)和B细胞表达，暴露于TLR9激动剂中的B淋巴细胞更容易被Ag激活以反映它们作为免疫增强剂的效用，而TLR9刺激pDC产生I型干扰素，从而更有效地将Ag呈递给T细胞[15-17]。

CpG ODN不仅能够刺激表达TLR9分子的细胞，引发免疫调节级联反应，最终产生Th1和促炎细胞因子和趋化因子，还能改善树突细胞、单核细胞和巨噬细胞的抗原呈递功能，诱导B细胞的增殖，刺激NK细胞的免疫保护活性，诱导机体内免疫应答反应更倾向于Th1型[18]，CpG ODN对不同宿主免疫环境具有不同的作用是它们作为高效免疫增强剂的价值基础。

3 CpG ODN作为免疫增强剂的作用

3.1CpGODN在预防和治疗感染中的作用CpG ODN主要是通过诱导体液免疫以预防感染的，即通过抗体中和作用或调理作用阻止病原体感染宿主细胞。CpG ODN通过激活TLR9信号，可以与B细胞抗原受体信号协同促进初始B细胞、已诱发B细胞和记忆性B细胞的激活，并进一步分化为分泌抗体分子的浆细胞[19]。一般来说，由于初始B细胞不具备表达TLR9的能力，所以其对于CpG ODN的激活作用并无响应，因此必须事先用抗原刺激初始B细胞以确保其被CpG ODN激活后可分化成浆细胞[20-22]。此外，IL-6是一种能够促进抗原特异性B细胞增殖及活化的细胞因子，由CpG ODN刺激的抗原特异性B细胞可分泌IL-6[23]。

3.2CpGODN在预防和治疗过敏中的作用在房尘螨和豚草诱发的变态反应中，pDCs捕获过敏原后会分泌IL-4和IL-5等Th2型细胞因子，这些细胞因子是通过诱导浆细胞产生过敏原特异性IgE而得到的[24-25]。过敏原特异性 IgE首先与肥大细胞上的IgE受体结合，然后当受体上的IgE与过敏原结合时，颗粒就会从肥大细胞中释放出来，从而引发流鼻涕和打喷嚏等过敏症状，持续暴露于过敏原会导致以肺嗜酸性粒细胞增多和气道阻塞为特征的肺部炎症[26]。过敏免疫疗法是一种通过过敏原疫苗诱导Th1免疫并抑制Th2免疫的治疗性技术。

CpG ODN既可以刺激pDC和B细胞，又可以诱导Th0细胞向Th1细胞的分化，由Th1细胞分泌的IFN-γ在降低Th2偏向反应的同时也会抑制IgE的分泌[27]。

3.3CpGODN在癌症免疫治疗中的作用CpG ODN由于具有激活获得性免疫应答和先天性免疫应答的能力，所以可在肿瘤治疗方面发挥巨大潜力且作为高效的肿瘤治疗剂而存在，CpG ODN不仅能够促进Thl、促炎性细胞因子的产生以及APC的成熟和活化，还能增强多肽类肿瘤疫苗的免疫原性。它诱导的细胞因子微环境能促进辅助性T细胞应答，这些特性使其可在临床研究中用作抗肿瘤的免疫增强剂[28]。Zhang等[29]研究表明，无论是在体外试验还是在动物试验中，CpG ODN均可通过多种途径进入不同组织并且产生积聚效应，从而在肿瘤组织中达到最高浓度，在MCF-7 荷瘤动物模型中，低剂量的CpG ODN即可抑制肿瘤生长达 40%，而作为免疫调节剂与抗肿瘤抗体药物赫赛汀联用，可抑制超过96%的肿瘤生长。由此可见，CpG ODN或许可作为一种独特的免疫调节剂应用于肺癌抗肿瘤治疗[30]。一般来说，CpG ODN独立用于癌症治疗虽然是相对安全的，但其诱导的免疫应答的强度并不足以消除肿瘤，所以目前有许多评估CpG ODN与其他免疫增强剂组合的免疫效果的研究正在进行。王凯玲等[31]为研究CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)对肺癌A549细胞化疗的影响，将肺癌A549细胞分为空白对照组、DDP组、CpG-ODN组、DDP + CpG-ODN组、CpG-ODN + DDP 组，采用CCK-8比色法检测细胞的增殖情况，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果发现，CpG-ODN与DDP联用具有促进癌细胞凋亡，从而提高顺铂化疗敏感性的能力。

4 安全性

CpG ODN在发挥高效免疫作用的同时，也会引发一些安全问题，比如CpG ODN会增强疫苗接种部位自身免疫蛋白的免疫原性从而引发自身免疫病；或者刺激细胞因子的产生使宿主对其他有害物质的易感性增强。

研究表明，大多数细菌DNA可以在正常小鼠体内引发抗双链DNA自身抗体的产生，并加速狼疮易发动物的自身免疫性疾病的发展，这些研究使CpG DNA促进自身免疫性疾病发展的特性得到了证实[32]。CpG DNA还能刺激IL-6的产生并阻断活化淋巴细胞的凋亡，通过促进自身反应淋巴细胞的持久性，使自身免疫性疾病的发生提前[33]。

目前存在很多评估CpG ODN在人体中的安全性和活性的临床研究。现有的结果表明，这些药剂是相对安全的，在某些情况下可以提高联合接种疫苗的免疫原性。临床研究想要达到的预期结果主要包括：鉴定在与特定疫苗共同施用时哪类ODN具有最佳活性，监测CpG ODN的长期安全性。期望进一步提高基于CpG的疫苗用于诱导针对感染性病原体的保护性免疫的效应。

5 展望

综上所述，CpG ODN能够靶向活化TLR9，具有强大的免疫刺激作用和促进Th1型免疫应答的特点，在作为免疫增强剂方面显示出来较好的应用前景。CpG ODN在人用乙型肝炎疫苗中已经通过了Ⅲ期临床研究。在动物疫苗如猪瘟疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗和犬细小病毒等疫苗中均具有较好的免疫增强作用。目前，CpG ODN的研究仍存在一些不足，如安全剂量和最佳给药途径等尚未明确，相信随着CpG ODN研究的不断深入，CpG ODN很可能作为一种在临床上广泛使用的免疫增强剂在人类和动物疾病的防控中发挥重要作用。