不同酶对牛骨素热反应香精气味及滋味的影响

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(1.北京工商大学食品学院,北京 100048; 2.湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司,湖南常德 415401)

在经过物理方法的处理后,清汤型骨素的蛋白质含量远比鲜骨要高,可以达到35%,而鲜骨中仅有11%左右。目前,骨素在食品工业中有一定应用,但因其风味不突出,尚有待改进。酶解法是常用的改善骨素风味的方法,能够为利用骨素开发复合型热反应香精提供反应基料。对高温蒸煮后的骨蛋白进行酶解反应,能够使蛋白质长链断开,形成较短的肽段,还能生成更多亲水性的小分子氨基酸,从而提高骨素产品的营养价值[6]。孙红梅等[7]对比了鸡骨素及其酶解液进行美拉德反应所得到产物的风味差异,最终确定热反应底物为鸡骨素酶解液。肖作兵等[8]研究了胰蛋白酶对猪骨素的酶促水解,得到了酶解的最佳工艺条件为酶解时间7 h,温度50 ℃,底物浓度为1∶1,pH7.5,加酶量0.7%。方端等[9]对酶法水解牛骨工艺进行了研究,并对酶解液风味进行了感官鉴定,得到最优方案:牛骨经90 ℃水浴条件下预处理30 min后,底物浓度设定为1∶14,初始pH6.6,温度为40 ℃,动物蛋白酶与底物比10000 U/g的条件下,酶解牛骨粉2 h。李迎楠等[10]酶解牛骨采用复合动物蛋白酶,其添加量为15 mg/g,酶解4 h;风味蛋白酶添加量为10 mg/g,酶解2 h。目前研究多集中于酶解鸡骨素[7,11]和猪骨素[8,12-14],直接酶解牛骨素的研究较少,对于不同酶酶解牛骨素制备美拉德反应香精的气味及滋味上的差异对比仍是空白。

本文采用固相微萃取结合气相色谱-嗅闻-质谱联用技术,测定美拉德反应香精中的挥发性风味物质,采用高效液相色谱仪测定氨基酸、核苷酸和肽分布等非挥发性呈味物质,阐述不同酶酶解对牛骨素制备美拉德反应香精的风味影响,进而推动骨素产品在食品工业上的应用,以期提高牛骨素产品价值,满足食品企业需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清汤型牛骨素、牛肉酶解液、水解植物蛋白(HVP) 湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司;复合蛋白酶(Protamex,47500 U/g)、复合风味蛋白酶500 MG(Flavourzyme,25000 U/g) 丹麦诺维信公司;木瓜蛋白酶PSM 500(60000 U/g) 比利时PSM有限公司;胰蛋白酶(猪胰,25000 U/g)、D-木糖、葡萄糖、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、硫胺素(VB1) 源叶生物科技有限公司;呈味核苷酸二钠(I+G) 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司;C7～C30系列烷烃、2-甲基-3-庚酮、混合氨基酸标准品、核苷酸标准品(5′-CMP、5′-GMP、5′-IMP和5′-AMP)、肽标准品(甘氨酸、抑肽酶、细胞色素C、杆菌肽、谷胱甘肽) 美国Sigma公司。

赛多利斯BSA224S-CW电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;HH-4数显恒温水浴锅,JI-1精密增力电动搅拌器 国华电器有限公司;YX-18DJ型YX系列手提式压力灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司;50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS) 美国Supelco公司;7890A-7000B气相色谱质谱联用仪 美国Agilent 公司;Sniffer9000嗅闻仪 瑞士Brechbuhler公司;毛细管柱DB-wax及DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美国J&W公司;1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司;Zorbax Eclipse-AAA柱、Agilent Eclipse XDB-C18柱 美国Agilent公司;TSK G2000 SWXL柱 日本Tosoh公司;FOSS KJELTEC 8400半自动凯氏定氮仪 丹麦Foss公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛骨素酶解液的制备 牛骨素中的基本化合物指标见表7,参考相关文献[15-17]。选择蛋白酶、风味蛋白酶500 MG、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶,以及四种酶的两两组合,在最适条件下酶解牛骨素,各骨素酶解条件见表1。通过预实验证明,在最适条件下,分步加酶与双酶在两种酶较优酶解条件下共同酶解的水解度差别并不大,这是由于骨素中盐含量高,导致各类酶的酶解进程较为困难,各组酶解液的水解度差异较小。而且分步酶解用时近8 h,不符合大多数企业的工业化生产要求,过长的酶解时间也会导致脂类物质的氧化哈败和异味物质增多的现象发生。为了简化工业生产步骤,统一采取共同的酶解方式进行实验。两种酶不同的温度则选择两种酶最佳酶解温度范围内的温度与pH,保证两种酶都能够进行酶解工作。在锥形瓶中准确称取100 g牛骨素,加酶后放入水浴锅中,利用精密增力电动搅拌器进行搅拌,充分酶解后在90 ℃水浴灭酶10 min,冰浴冷却降温后,立即进行水解度的测定及热反应香精的制备。为了图表直观性,统一采用S1～S10代表各种不同酶酶解得到的牛骨素酶解液制备出的热反应香精,酶和酶组合简写见表1。

表7 牛骨素中基本化合物含量表Table 7 The content of basic substances in bovine bone extract

表1 酶解牛骨素条件表Table 1 The condition of enzymatic hydrolysis of bovine bone extract

1.2.2 热反应香精的制备 通过参考相关文献[18-19],并进行前期预实验,得到美拉德反应配方如下:牛骨素酶解液30 g,蒸馏水14 g,牛肉酶解液6 g,葡萄糖0.5 g,木糖1 g,半胱氨酸0.5 g,半胱氨酸盐酸盐0.4 g,VB10.5 g,HVP 5 g,I+G 0.5 g,在120 ℃热反应60 min。热反应结束后,冰浴冷却降温后,在4 ℃冰箱储存24 h后进行气相色谱-嗅闻-质谱及高效液相色谱分析。

家庭是构成社会的基本元素，家庭的生存状态是社会发展水平的标志。以往的城乡规划关注企业胜于关注家庭，关注劳动力资源胜于关注劳动者本身。大量农民工的出现，导致了农村家庭的碎片化和离散化、留守人群关爱的缺失，以及远程通勤造成经济负担和资源的浪费等等。城乡规划应从家庭的完整性、聚合性和生活质量方面，对就业、居住和公共服务进行规划，使城乡聚落适宜于家庭生活，而非人口和劳动力集聚的空间。

1.2.3 水解度(DH)的测定 氨基酸态氮采用甲醛滴定法进行测定[20]。准确吸取5 mL酶解液至容量瓶,稀释至100 mL,取20 mL稀释液加入60 mL蒸馏水混匀,在磁力搅拌器进行搅拌状态下,用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至pH=8.2,加入10 mL甲醛溶液后继续滴定至pH=9.2,记录消耗的NaOH溶液体积。80 mL蒸馏水在相同条件下进行滴定,作为空白溶液。溶液中氨基酸态氮含量的计算公式为：

式中:x为溶液中氨基酸态氮的含量(g/100 g);V1为滴定样品时pH从8.2～9.2所消耗的NaOH溶液体积(mL);V2为滴定空白溶液时,pH从8.2～9.2所消耗的NaOH溶液体积(mL);V3为参与反应的稀释液体积(mL);C为NaOH溶液浓度(C=0.05 mol/L)。

总蛋白质含量通过FOSS半自动凯氏定氮仪进行测定[21]。消化程序为200 ℃消化30 min,升温至420 ℃消化1 h。水解度的计算公式为：

DH(%)=(氨基酸态氮含量/总蛋白质含量)×100

1.2.4 感官评价 感官鉴评小组由北京工商大学分子感官科学实验室的12名成员(6男6女,年龄20～50岁)组成,每名小组成员均接受过至少400 h的感官训练,并且均具有评价牛肉香精的经验,感官训练标准溶液配制方法见表2。通过小组成员讨论,肉味香精选择从气味及滋味两方面进行评价,其中气味包括肉香、烤香、焦糖香、焦糊味、硫臭味、腥味、酸味共7项指标;滋味包括酸味、甜味、苦味、鲜味、醇厚感和后味共6项指标,气味及滋味评分标准见表3及表4。样品用蒸馏水稀释50倍,并打乱序号,用水浴锅调整样品温度至37 ℃,品评员对样品进行描述性风味感官鉴评并打分。感官指标的评分采用10分制,0分代表未感知,10分代表极强烈,强度逐渐增加[22]。

表2 感官训练标准溶液配制方法Table 2 The preparation method of standard solution for sense training

表3 气味感官评价标准表(分)Table 3 Sensory evaluation standard for flavor(score)

表4 滋味感官评价标准表(分)Table 4 Sensory evaluation standard for taste(score)

1.2.5 挥发性香气化合物的提取、定性和定量

1.2.5.1 挥发性香气化合物的提取 采用固相微萃取(solid-phase micro-extraction,SPME)方法对10种热反应香精的挥发性香气物质进行提取。在40 mL顶空瓶中加入10 g样品,并打入浓度为0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮溶液1 μL作为内标物,混匀后密封。将样品置于55 ℃水浴中平衡20 min,插入固相微萃取纤维头(DVB/CAR/PDMS),顶空吸附40 min。萃取结束后,立即将萃取头插入气相色谱仪前进样口中进行热解析,于250 ℃条件下解析5 min进样。

两种不同极性的毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)被用来进行化合物的分离与验证,包括DB-wax(极性柱)和DB-5(非极性柱)。升温程序如下:初始温度40 ℃保持3 min,以5 ℃/min 升温到200 ℃,再以10 ℃/min升温到230 ℃,保持3 min,共41 min。载气为氦气,流速1.2 mL/min,不分流进样。质谱条件:电子轰击(electron impact,EI)离子源,电子能量为70 eV,传输线温度280 ℃,四极杆温度150 ℃,离子源温度230 ℃,质量扫描范围m/z为40～450 amu。GC-O温度设定为200 ℃,嗅闻过程中有湿润蒸气与气味物质一起通过嗅闻口进入鼻腔,以降低干燥空气对鼻腔粘膜的伤害,每组嗅闻由5名以上嗅闻人员单独进行嗅闻实验,气味描述记录为每种气味活性化合物至少三名嗅闻人员的相同描述。

1.2.5.2 挥发性香气化合物的定性分析 通过3种方法共同对未知挥发性香气化合物进行定性分析,对挥发性香气化合物的RI值进行计算,并与文献报道的气味化合物保留指数(retention index,RI)[23]对比,NIST14软件质谱谱库检索,并进行嗅闻数据对比。RI值的计算公式如下。

式中,N为待测气味化合物a左侧出峰的正构烷烃的碳原子数;n为a两侧的两个烷烃之间相差的碳原子数(n=1);tR为相应化合物的保留时间。

1.2.5.3 挥发性香气化合物的定量分析 本实验只需对比定量关系,因此选取内标法进行半定量分析。

其中,Ci为被测化合物浓度(μg/μL);Cis为内标浓度(μg/μL);Ai为未知化合物的色谱峰面积;Ais为内标物的色谱峰面积。

1.2.6 氨基酸的测定 实验采用Agilent 1260高效液相色谱系统进行16种游离氨基酸(Asp、Ser、Glu、Gly、His、Thr、Ala、Tyr、Arg、Cys、Met、Val、Phe、Leu、Ile、Lys)的定量分析检测,分离柱为Zorbax Eclipse-AAA,酶解液与香精样品按1∶5 (v/v)以超纯水稀释,通过0.22 μm滤膜后,采用Henderson等[24]的方法,利用OPA和FMOC柱前衍生法进行测定。将16种氨基酸混合标准试剂(1 nmol/μL)将氨基酸用0.1 mol/L HCl稀释配制成不同浓度的混标进样,分别绘制标准曲线,计算各氨基酸浓度。

高效液相色谱(HPLC)条件:采用Zorbax Eclipse-AAA(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱;流动相:盐相A:40 mmol·L-1NaH2PO4的水溶液,用NaOH调至pH7.8;有机相B:甲醇-乙腈-水溶液(45∶45∶10,V/V/V)。流速为1 mL/min。进样量为1 μL。紫外检测波长为338 nm。柱温设置为40 ℃。

1.2.7 核苷酸的测定 核苷酸的测定参考Cho等[25]的方法,采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,外标法定量。酶解液与香精样品按1∶5 (v/v)以超纯水稀释,通过0.22 μm滤膜。

HPLC条件:流动相:盐相A:40 mmol/L KH2PO4,用H3PO4调pH=3.8;有机相B:10%甲醇-水溶液,流速为1 mL/min。进样量为1 μL。紫外检测波长为254 nm。柱温设置为35 ℃。

1.2.8 肽分布的测定 采用凝胶色谱柱TSK gel G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm,5 μm)对样品的肽分子质量分布进行测定。选用的标准品包括甘氨酸(75Da)、谷胱甘肽(307 Da)、细胞色素C(885 Da)、杆菌肽(1423 Da)、抑肽酶(6512 Da),制作分子量标准曲线,以确定肽分子质量大致分布。

HPLC条件:流动相:20%乙腈水溶液,用甲酸调整pH3.0。流速0.5 mL/min。进样量1 μL。紫外检测波长为215 nm。柱温设置为25 ℃。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0软件对数据单因素方差分析(ANOVA)和邓肯多量程试验(Duncan’s multi-range test),每个实验在相同条件下重复三次。

2 结果与分析

2.1 不同酶对牛骨素酶解液水解度(DH)及感官评价的影响

热反应香精的感官评价与DH的关系见图1。从图1中可以得到,S5(复合蛋白酶+复合风味蛋白酶)、S6(复合蛋白酶+胰蛋白酶)、S10(胰蛋白酶+木瓜蛋白酶)这三种组合酶解得到的DH较高,四种单酶酶解DH差别不大,在这四种酶中,复合风味蛋白酶为内切酶,其余三种均为外切酶,外切酶与内切酶的组合中,复合风味蛋白酶与复合蛋白酶配合最好,DH最高,而与胰蛋白酶和木瓜蛋白酶配合,均降低了DH。这可能由于只有复合蛋白酶和复合风味蛋白酶酶解条件最相似,能够发挥最大功效,能够配合发挥其最大效果。同时,DH的升降也与感官评价得分的高低呈现相似的趋势,通过前期研究发现,牛骨素DH在10%～15%范围内,制备出的热反应香精风味最佳,在该范围内,DH越高,感官评分也越高,复合蛋白酶和复合风味蛋白酶的组合气味和滋味总分最高。

图1 不同酶对牛骨素水解度(DH)与美拉德反应香精感官评价的影响Fig.1 The influence of different enzymes on degree of hydrolysis of bovine bone extract and sensory evaluation for Maillard reaction flavorings

2.2 不同酶对热反应香精挥发性风味成分的影响

由于测定酶解液挥发性风味成分意义较小,故本实验针对10种酶解液制备的热反应香精进行了固相微萃取协同GC-O-MS进行分析,共得到64种气味物质。对表5中的数据进行统计,可以发现,10种香精中呈现烤香味、肉香、焦糖香等典型的牛肉香精风味物质的总量如表中最后一行所示,这些物质包括文献中已有报道的甲硫氨酸的Strecker降解醛3-甲硫基丙醛(煮土豆味)[26-27];脂肪氧化降解产物正辛醛和壬醛(脂味)[26-28];含硫氨基酸-半胱氨酸降解及美拉德反应产生的2-乙酰噻唑(烤香味)[26-27];半胱氨酸降解产生的硫化氢和还原糖脱水产物5-甲基-4-羟基-3(2H)呋喃酮反应所形成的2-甲基-3-呋喃硫醇(肉味)[29-30];半胱氨酸降解释放H2S,参与到美拉德反应中形成呈肉香的挥发性含硫化合物糠硫醇(烤香味)[26-27];由2-甲基-3-呋喃硫醇形成的二硫醚类物质双(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚(烤肉味)[26-27]等。除此之外,还包括呈现强烈烤香的2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2,3-二甲基哌嗪,呈现焦糖香气的甲基麦芽酚,这些物质对于牛肉香精天然柔和的肉味和烤香、焦糖香气都有不可或缺的作用,故也计算在内,作为计算肉味香精典型香气化合物含量指标。在典型肉味香精香气含量对比中,含量最高的是S9(复合风味蛋白酶+木瓜蛋白酶)的组合,高达75.49 ng/g,S5(复合蛋白酶+复合风味蛋白酶)组合含量居第二位,达到68.27 ng/g。在四种单酶肉味香精中S4(木瓜蛋白酶)牛骨素酶解液美拉德反应后肉香味物质含量较高,达到31.71 ng/g;S1(复合蛋白酶)酶解制得香精的肉香味物质含量是最低的,仅9.32 ng/g。

表5 10种不同酶酶解制备热反应香精挥发性风味成分的GC-O-MS分析结果Table 5 GC-O-MS analysis of volatile flavor compounds in the preparation of thermal reaction flavor by 10 different enzymes

续表

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2.3 非挥发性呈味物质分析

2.3.1 不同酶对氨基酸及滋味活性值(TAV,Taste active value)的影响 滋味活性值为样品中测定的滋味化合物浓度与其在水中或简单的溶解基质中测量的阈值之比,TAV>1认为该化合物具有滋味活性[31]。滋味阈值数据通过查阅文献得到[32]。热反应香精氨基酸分析结果及TAV值对比见表6。图2～图4展示了美拉德反应香精与酶解液中呈现鲜味、甜味与苦味氨基酸的对比,蛋白酶单独酶解及其与其他酶共同酶解的三种组合中,单独利用复合蛋白酶(S1)酶解得到的酶解液中鲜味氨基酸含量是最少的,当加入了木瓜蛋白酶之后,二者共同酶解(S7)使美拉德反应香精鲜味氨基酸大大增加,达到1.02 g/L,复合蛋白酶与复合风味蛋白酶组合(S5)对改善滋味也大有益处,美拉德反应香精鲜味氨基酸达到0.99 g/L;苦味氨基酸总量中,复合风味蛋白酶单独酶解得到的酶解液,其苦味氨基酸含量远高于其他,在配合了其他酶之后,苦味氨基酸含量大大降低。在10种香精的制备过程中,均加有半胱氨酸和半胱氨酸盐酸盐,这两种氨基酸作为美拉德反应的重要前体物,是制备热反应香精过程中所必需的,但由于半胱氨酸无味感,故对本实验结果无影响。复合蛋白酶+木瓜蛋白酶组合(S7)的鲜味氨基酸含量是最多的,但与此同时,苦味氨基酸含量也很高,所以对整体味感的平衡有所破坏,同样鲜味氨基酸也较高的复合风味蛋白酶+木瓜蛋白酶的组合也是苦味氨基酸含量高,对比发现,复合蛋白酶+复合风味蛋白酶组合(S5)的鲜味氨基酸含量高,苦味氨基酸含量低,甜味氨基酸含量适中,制备出的香精味感圆润、柔和,是最佳的组合酶。

表6 不同酶制备牛骨素热反应香精的氨基酸及TAV分析结果Table 6 The analysis of content of amino acids and TAV in thermal flavorings made by different kinds of enzymes

图2 不同酶对牛骨素酶解液与美拉德反应香精中鲜味氨基酸含量的影响Fig.2 The influence of different enzymes on the content of umami-taste amino acids in bovine bone extract enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings

图3 不同酶对牛骨素酶解液与美拉德反应香精中甜味氨基酸含量的影响Fig.3 The influence of different enzymes on the content of sweet-taste amino acids in bovine bone extract enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings

图4 不同酶对牛骨素酶解液与美拉德反应香精中苦味氨基酸含量的影响Fig.4 The influence of different enzymes on the content of bitter-taste amino acids in bovine bone extract enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings

2.3.2 不同酶对核苷酸的影响 核苷酸含量对比如图5所示,蛋白酶+风味蛋白酶组合(S5)中,不论是酶解液中,还是热反应香精中,其呈鲜味核苷酸含量均为最高,由表7中可以得到牛骨素中核苷酸含量并不丰富,仅0.136 g/L,经过酶解后,各酶解液核苷酸含量均迅速增加,蛋白酶+风味蛋白酶组合(S5)核苷酸总量更是增加至0.530 g/L,约是未酶解骨素的4倍,其中S5香精中的核苷酸含量最高为15.69 g/L，这可能由于酶解过程破坏了牛骨素中的细胞,溶解出更多的核苷酸类物质,这些核苷酸可以作为美拉德反应前体物,产生更多的挥发性肉香味化合物和不挥发性滋味物质[33]。

图5 不同酶对美拉德反应香精与酶解液中核苷酸含量对比组合图Fig.5 The comparison of the content of taste-active nucleotides in enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings made by different enzymes

2.3.3 不同酶对肽分布的影响 经酶解后生成的肽作为香味形成的重要前体物,可以与还原糖、氨基酸、脂肪酸和硫胺素等风味前体物发生系列反应,不仅能产生特征香味,而且比起其他前体物参与的美拉德反应所产生的挥发性芳香物质更为丰富[34]。王然等[35]对谷胱甘肽-木糖美拉德反应体系形成肉类风味的形成机制进行了研究,结果表明谷胱甘肽在肉香味化合物产生过程中起了很大的作用。Lancker等[36]模拟了以赖氨酸的-NH2为N端的二肽与葡萄糖、甲基乙二醛和乙二醛发生的美拉德反应,反应产生了吡嗪类的混合芳香物质,而且与游离氨基酸参与的美拉德反应相比,此二肽反应产生的吡嗪等香味物质更浓。文献中提到,呈现鲜味和浓厚感的肽,大多在200～1000 Da[37-41],故本实验以<1000 Da肽分布作为指标,以探索酶种类对肉味香精丰满的口感的影响,结果见图6。结果表明,酶解液中复合蛋白酶+木瓜蛋白酶(S7)酶解效果最差,其<1000 Da肽分布最低,仅10.15%;复合蛋白酶+复合风味蛋白酶(S5)效果最佳,达到33.73%。这些肽可以参与到Maillard反应中,并且生成特征气味物质,增加肉味香精的感官品质。在香精中,<1000 Da肽分布最多的仍然为复合蛋白酶+复合风味蛋白酶(S5)组合,达到38.52%,制备的牛肉香精会由于小分子肽类的存在而增加鲜味和浓厚感。综上,复合蛋白酶+复合风味蛋白酶组合(S5)亦是获得呈味肽类的最佳组合酶。

图6 不同酶对牛骨素酶解液与美拉德反应香精中<1000 Da肽分布的影响Fig.6 The influence of different enzymes on <1000 Da peptide distribution in enzymatic hydrolysate of bovine bone extract and Marillard reaction flavorings

3 结论

本实验结果显示,复合蛋白酶与复合风味蛋白酶组合酶解牛骨素效果最佳,其制备香精感官评价得分最高,香精牛肉香气突出,圆润柔和。挥发性气味化合物方面,典型肉味香精风味物质达68.27 ng/g。滋味化合物中,鲜味氨基酸含量高达0.99 g/L,鲜味氨基酸含量在10种香精中排名第二,且苦味氨基酸含量低,味感平衡。复合蛋白酶和复合风味蛋白酶组合制备的香精核苷酸含量最高,达到15.69 g/L;<1000 Da肽分布占比38.52%。整体肉香浓郁、持久,口感圆润柔和,综合各项指标,确定复合蛋白酶与复合风味蛋白酶为酶解牛骨素制备热反应香精的最佳组合酶。