全二维气相色谱在食品风味化学成分分析中的应用

肖 雪，吴惠勤，陈啸天，郭鹏然，宋化灿，向章敏

(广东省测试分析研究所 广东省化学危害应急检测技术重点实验室,广东 广州 510070)

食品风味是人们对由食物或饮料产生的气味、口味和刺激性之间相互作用或整体的感觉[1]，是评价食品品质特征的重要指标。研究食品风味，需了解风味物质的成分并进行分析，一些挥发性化合物已被证明是食品风味的重要贡献者[2-5]。随着感官组学、风味组学、代谢组学等研究方法的兴起，通过对样本成分及其相关属性进行全面综合的分析，判断食品的挥发性成分与原料、来源及其生产过程的关系[2-3,5-7]，进而阐明感官活性化合物与人体嗅觉刺激的关系[8]，可对食品的营养价值、加工过程进行有效控制和评定。目前，食品风味化学成分的检测方法有气相色谱法(GC)[9]、气相色谱/闻香器(GC/O)[10-11]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[12-13]等，但这些方法存在杂峰干扰、分离度不够、峰容量小等缺点。近年来，全二维气相色谱技术(GC×GC)的应用使食品风味成分分析有了新突破，将其与顶空分析技术(HS)、固相微萃取技术(SPME)、同时蒸馏萃取法(SDE)等结合，在香气成分族分离和指纹识别[14]、目标挥发性化合物分析[15]和未知物鉴定[7]方面具广阔的应用前景。

GC×GC在复杂化合物的色谱分离中具有可提供高峰容量、高灵敏度、高分辨率，并能产生结构化的二维轮廓图，有助于化合物的鉴定等优势[7,14-20]，这主要得益于在全二维气相色谱中样品经两次独立的分离并在第一次分离运行的同时完成二维分离，能够在相当短的时间内提供相当多成分信息[14]。1991年，Liu和Phillips首次报道了全二维气相色谱技术(GC×GC)[21]，成为经典一维色谱一次很好的升级。使用GC×GC对样品分离因至少基于其两个具体的化学性质(如挥发性、极性或手性)，较好地增加了峰容量和分离能力，可使性质相似的化合物成功分离开来[22]。因此，全二维气相色谱被广泛应用于环境[23]、植物[24]、石油[25]等领域。向章敏等基于全二维气相色谱解析了烟气中的酸性[26]、碱性[27]和中性[28]化学成分，并建立了烟叶中多种挥发性香味成分[29]和生物碱成分[30]的快速检测方法。Dimandja等[31]首次使用GC×GC结合氢火焰离子化检测器(FID)对食品进行分析，开辟了GC×GC在食品领域的应用。随后，更多的研究报道将GC×GC与质谱联用应用于食品加工监测[32-34]、食品新鲜度评估[35-36]、食品真实性评估[37-38]、食品污染评估[39-40]、食品检测[41-42]等食品分析领域。

食品风味物质的分析通常采用一维气相色谱(1D-GC)或气相色谱-质谱(GC-MS)联用法，但由于某些食品风味成分组成和基质复杂，一维气相色谱难以实现完全分离，而全二维气相色谱通过将分离机理不同而又相互独立的两根色谱柱以正交方式组合，极大地提高了色谱的分离能力和分析速度，可满足于食品风味物质复杂化学成分的二次分离。本文综述了全二维气相色谱技术在未经二次加工的食品(如水果、蔬菜和肉类)和经过二次加工的食品(如乳制品、饮品和调味品)中风味物质的分析方面的应用，旨在为食品风味化学成分的分析提供借鉴。

1 食用农产品

1.1 水 果

水果的风味来源于其所含糖类、蛋白质、油脂和维生素等基本的营养物质[43]。草莓的风味通常决定其品质，进而影响消费者的选择，Williams等[4]采用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合全二维气相色谱/氢火焰检测器(GC×GC/FID)分析了草莓挥发物，该方法将第一维手性柱和第二维极性柱(BPX50,50%苯基聚硅氧烷-硅氧烷)直接耦合，分离了草莓中部分具有手性结构的风味物质，发现2,5-二甲基-4-羟基-(2H)-呋喃-3-酮(DMHF)主要以(-)-对映体形式存在，芳樟醇主要以S-对映体形式存在。Samykanno等[44]利用全二维气相色谱飞行时间质谱联用仪(GC×GC-TOF MS)研究了澳大利亚生长的Albion和Juliette草莓的挥发性成分，解决了一维色谱难分离的问题，在这两种草莓中共检出94种化合物，其中20种化合物用一维色谱无法检出。该研究发现Juliette糖/酸比和Albion的相比略大，且2,5-二甲基-4-羟基-(2H)-呋喃-3-酮(呋喃酮)仅在Juliette中检出，2,5-二甲基-4-甲氧基-(2H)-呋喃-3-酮在Juliette中占比较大，这些很好地解释了两个草莓品种甜度上的差异。刺果番荔枝具有一种令人愉快、类似于奶油味的独特香气，Cheong等[45]采用HS-SPME结合GC×GC-TOF MS在刺果番荔枝中检出135种化合物，其中21种酯、6种醇、3种萜烯、2种酸、2种酮、2种醛和1种芳香族被认为是影响刺果番荔枝风味的关键挥发性化合物。菠萝是一种比较受欢迎的热带水果，Steingass等[46]采用HS-SPME/GC×GC-qMS对早期成熟、收获后成熟、上货架末期成熟以及完全成熟时收获的空运菠萝中的挥发性成分进行了比较，鉴定出酯、萜烯、醇、醛、2-酮、游离脂肪酸和各种γ-和δ-内酯等291种挥发性成分，并通过GC×GC获得的结构化分离图谱揭示了各种同系列的化合物类别及倍半萜聚类情况。

1.2 蔬 菜

番茄和洋葱是加工食品中常用蔬菜，Koutidou等[47]采用GC-MS和GC×GC-TOF MS测定了在加热处理番茄洋葱泥过程中的气味活性化合物，其中GC-MS仅鉴定出18种化合物，为了提高分离效果，解决共洗脱问题，改善一维色谱分离后未确定气味活性化合物的鉴定情况，作者利用全二维气相色谱进行分离，以Rxi-5-Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)为第一根柱，BPX-50(1.15 m×0.1 mm×0.1 μm)为第二根柱，共鉴定出27种化合物。甜椒具有辛辣味的口感和独特的香气，并富含抗氧化物质(如类胡萝卜素和维生素C)，通常可直接食用或用于辅助调味[48-49]。Gogus等[50]采用微波辅助萃取/GC×GC-TOF MS在新鲜红辣椒、传统和工业制造辣椒酱中分离鉴定出15种醇、14种萜烯、13种醛、12种酮、7种脂肪酸、6种脂肪酸酯和6种褐变反应产物共79种化合物，并发现2-戊酮、3-己醇、乙酸、油酸和亚油酸在新鲜辣椒和辣椒酱均有检出，而(E)-2-十一烯醛、法尼醇、2-十五碳炔-1-醇、亚麻酸和角鲨烯仅在新鲜辣椒中检出。二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、糠醛、糠醇、甲基糠醛、3-甲基-2(5H)-呋喃酮和5-羟甲基糠醛等褐变反应产物在传统和工业制造的辣椒酱中均有检出，且其浓度在工业制造中要高得多，工业制造辣椒酱中只检出39种挥发物，传统制造辣椒酱经微波辅助正己烷提取的挥发物数量最多(共64种)，而且在传统制造的酱中才能观察到许多具有令人愉快的香气特征物质。

1.3 肉类食品

海鲜中挥发性物质的产生受物种来源、环境、成熟度、生物因素、加工条件等影响，而这些挥发性物质与其质量和安全水平密切相关[51]。Leduc等[52]利用动态顶空气相色谱嗅觉装置(DH-GC/O)以及全二维气相色谱与嗅觉装置和质谱联用(GC×GC-MS/O)对储存了1、4、15 d的石斑鱼风味物质进行分析，以寻找新鲜或腐坏的标志性物质。结果在石斑鱼中检出144种挥发性化合物，其中硫代甲烷、噻吩、甲苯、丁酸乙酯、己醛、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、二甲基-三硫醚、辛醛、1-壬烯-3-醇、(E)-2-壬烯醛和2个未知化合物被认为与其气味相关，并确认噻吩、己醛、1-辛烯-3-酮、二甲基-三硫醚和1-壬烯-3-醇可作为石斑鱼新鲜或腐败的标志性物质。Jin等[53]通过GC×GC-TOF MS分析发现鱿鱼样本中含有184种挥发性化合物，包括39种芳香烃、22种脂肪烃、21种酯、20种醛、19种醇、18种磺基化合物、17种含氮化合物、14种酮、6种酸、5种呋喃和3种酚;与GC-MS分析结果相比，有119种化合物为首次报道。由此可见，全二维色谱比一维色谱能提供更多海鲜中挥发性物质的检测数据。烹饪过程中氨基酸和还原糖的曼德拉反应及油脂的热降解是香气挥发的主要原因[54]。Rochat等[7]将100 μm的聚二甲基硅氧烷固相微萃取纤维头插入冷凝器中提取烹饪过程中产生的挥发物，再采用GC×GC-TOF MS分析鉴定了烤箱烘烤的牛肉香气中的硫醇类、硫化物、噻吩和噻唑等含硫化合物，该文采用多元线性回归模拟辅助峰的识别，但模拟的准确性在识别同分异构体方面仍不足，作者又将GC×GC-TOF MS和GC/O相结合，从而鉴别了烤牛肉过程中释放气体中的含硫组分，并确认了苯乙硫醇、异丙基苯硫酚、二苯硫醚、甲基糠基二硫、二苯二硫醚和二甲基二硫醚6种关键性物质。德州扒鸡是中国有名的一种传统美食，Duan等[55]以加速溶剂提取和溶剂辅助蒸发法(ASE-SAFE)从德州扒鸡中提取挥发性成分，并采用全二维气相色谱-高分辨率飞行时间质谱法(GC×GC/HR-TOF MS)和GC-qMS进行检测，发现前者可鉴定出91种化合物，而后者仅识别44种。研究认为，德州扒鸡主要气味活性成分为羰基化合物(33.04%)，其中2-位烯醛类和2,4-二烯醛类是其最重要的气味活性成分，但(E)-2-十一烯醛、(E)-2-壬烯醛、(Z)-2-十二烯醛、(E)-2-十一烯醛、(E,E)-2,4-己烯醛、庚二烯醛和(E,E)-2,4-壬二烯醛6个具有极性而且不稳定的2-位烯醛类或2,4-二烯醛类仅可通过GC×GC/HR-TOF MS鉴定，进一步说明了全二维气相色谱在肉类食品风味物质方面的检测优势。

2 加工食品

2.1 乳制品

乳制品中风味化学分析常因乳品的异质性而变得复杂，其所含脂类、蛋白质和碳水化合物会导致风味物质在采用一维色谱时难以分离，且部分风味化合物因样品状态而异。因此，与加热或加工的乳制品相比，生乳品会显示出的独特气味常由酯类物质决定，其中内酯和杂环化合物存在于热处理和巴氏杀菌牛奶中。另外，发酵的特色乳制品(如奶酪和酸奶)由于水解而存在脂肪酸产物[56]。Adahchour等[57]以乙醚萃取酸奶中的风味物质，并用GC×GC-TOF MS检测。结果显示，甲硫基丙醛和葫芦芭内酯需从复杂的乳制品提取物中得到分离和鉴定，但其共洗脱容易产生2-庚酮和2-壬酮2个主峰，而甲硫基丙醛(m/z104)和葫芦芭内酯(m/z128)却大量存在于共洗脱背景中，普通的一维GC-MS无法实现分离。而采用GC×GC-TOF MS检测时，背景干扰显著消除，两种目标分析物的质谱清晰可见，并可在40～90 ng/g范围内直接定量。同时，δ-和γ-内酯、醛类、醇类、酮类和酸类通过CP-Sil 5 CB × BPX-50组合柱实现了有效的分离，结构也得以确认。此外，对于C14～C18有机酸类，GC×GC也消除了一维色谱检测微量成分时的拖尾现象，达到准确定性的目的。Yue等[58]采用固相微萃取/GC×GC-TOF MS研究牛奶中的挥发性物质，该方法不仅分离出传统GC-MS共洗脱的52种化合物，还首次鉴定了包括脂肪族碳氢化合物(69种)、芳香族碳氢化合物(42种)、酮类(28种)、酯类(16种)、醛类(14种)、醇类(14种)、酸类(14种)、含氮化合物(9种)、醚类(8种)和磺基化合物(3种)共107种挥发物，其中5种主要的挥发物依次为己酸(193.57 ng/mL)、甲氧基苯基肟(114.83 ng/mL)、辛酸(109.38 ng/mL)、4,5-二甲基-1-己烯(101.48 ng/mL)和2-戊酮(99.74 ng/mL)，可为改善牛奶品质提供数据支撑。而高品质黄油类乳制品的典型风味取决于其原材料、细菌的代谢活性、加工工艺、存储条件等[59]因素。Adahchour等[2]用HS-SPME提取黄油中的挥发物，并采用1D-GC和GC×GC/FID-TOF MS进行测定，鉴定了包括醛、2-烯醛、酮、脂肪酸和内酯在内的几类化合物。经分析发现，热处理黄油样品后，呋喃衍生物、杂环化合物、吡咯和吡啶等只能在热处理后的样品中找到。由于分离和检测性能问题，1D-GC不能对几种含有m/z99和71离子峰的化合物进行鉴定，而这些化合物被GC×GC-TOF MS鉴定为δ-内酯。因此，GC×GC能够对目标化合物进行更可靠的分析，能快速识别出更多的未知风味化合物。

2.2 饮 品

果汁是以水果为原料经过物理方法(如压榨、离心、萃取等)得到的汁液产品，具有不同风味的果汁饮料受到广大消费者的喜爱。Komura[60]通过采用GC×GC/FID在变质果汁中检出β-甲基苯乙酮和β-甲基异丙基苯-8-醇等化合物，并确定其为饮料变质的标志性化合物。Mastello等[61]通过GC×GC/HR-TOF MS对存在于巴氏杀菌橙汁中的风味物质进行了鉴定，确认了4种醛(己醛、庚醛、辛醛和柠檬醛)、2种酯(丁酸乙酯和己酸甲酯)和4种单萜(α-蒎烯、D-苎烯、芳樟醇和α-松油醇)可作为果汁的风味特征物质。红茶在我国深受广大消费者喜爱，其所含酚类化合物和黄嘌呤是影响茶味道及颜色的主要成分，而挥发物不仅是确定其特有香气的基础，也提供了几个其他特征信息，如品种、地理来源、贮藏和处理方式等。GC×GC-TOF MS 技术使得分析的茶叶香气化合物数量提高了数倍，一定程度上弥补了一维气相色谱分析的不足，为茶叶香气组分的进一步研究奠定了技术基础。 Magagna等[62]采用HS-SPME和多组分纤维取样技术，利用自动化的工艺流程全面回收95%的关键气味物质，并结合GC×GC-MS研究了红茶挥发性组分的特征信息，检出包括气味剂以及工艺和植物学的示踪剂等在内的123种化合物，再利用模式识别对二维图谱数据进行处理，可为红茶质量评价提供丰富的化学信息。此外，利用GC×GC-TOF MS方法研究西湖龙井茶[63]、六堡茶[64]、绿茶[65]、铁观音[66]等茶叶中风味物质也有很多报道。

2.3 调味品

调味品是餐厅及家庭最常见的辅助调香用品，也越来越多的应用于保健品、化妆品和防腐剂中[67]。胡椒是被多样化消费的品种，具有很高的经济价值[68]，Cardeal等[69]采用GC×GC/FID、GC×GC-qMS和GC×GC-TOF MS分析了13种胡椒和胡椒粉样品，以75 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)固相微萃取纤维头进行HS-SPME前处理，再比较GC×GC/FID和GC×GC-qMS指纹图谱信息。结果显示，GC×GC-TOF MS比GC×GC-qMS检出峰多约5倍，在巴西胡椒中，GC×GC-TOF MS可鉴别700多种化合物，而GC×GC-qMS仅鉴别出139种。镇江香醋是我国受欢迎的传统调味品，Zhou等[70]采用GC×GC-TOF MS和GC/O分析镇江香醋中的芳香性气味，并通过质谱匹配因子、结构信息和线性保留指数共确证了360种化合物，其中酮类物质最多，其次为酯类、醛类、醇类和呋喃类衍生物。将该结果与GC/O相应区域的气味测定结果进行结合，确认甲硫醇、2-甲基-丙醛、2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛、辛醛、1-辛烯-3-酮、二甲基三硫化物、三甲基吡嗪、乙酸、3-(甲硫基)丙醛、糠醛、苯乙醛、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸和乙酸苯乙酯为镇江香醋特征的风味成分，该研究表明从复杂基质中快速识别关键性气味可通过GC×GC-TOF MS和GC/O的联合使用来实现。香料一般是整株植物或植物的一部分，可以是新鲜或干燥的，整个的、切碎或磨碎的，由于其特有的颜色，香气或风味，常被用于食物和饮料中以增强味道和吸引力。与新鲜香料相比，干香料在保存的过程中只有缓慢的质量损失，因此，人们更多地选择干香料[71]。Maikhunthod等[72]将HS-SPME、GC/O与使用极性/非极性柱相组合的GC×GC/FID用以识别干茴香种子中的风味化合物，并将GC-O/FID数据与GC×GC-TOF MS分析保留指数相关联，初步确认了柠檬烯、1,8-桉树脑、松油烯-4-醇、草蒿脑和反式茴香脑为茴香芳香气味的主要化合物。该文还测定了干茴香在半年到五年时间之内的风味物质变化，发现鼻腔冲击频率随着时间的增加平均减少30%～50%，而代表“新鲜”的单萜烯(如β-蒎烯和β-月桂烯)，仅对半年的产品风味有影响，倍半萜烯和倍半萜氧化物的含量在5年内相应的增加，这被认为是一种老化的标志，另外，茴香醛气味强度在不同保存时间内均保持不变。由此可见，全二维气相色谱技术是追踪风味变化过程的重要分析手段。

3 展 望

食品讲究色、香、味、形，其中香与味是食品最重要的关键性指标之一。随着国民经济的发展以及人民生活水平的提高，越来越多的食品风味趋向多元化，人们更加喜欢香味浓郁、具有特殊风味的食品;同时食品存储、加工、调配等过程中的也会产生风味变化，成分更加复杂，因此，关注食品风味特征化学成分的研究与分析将成为热点。全二维气相色谱具有分离能力强、峰容量大、选择性高等特点，是一种非常适用于复杂样品的色谱分离技术，尤其是在食品领域。本文阐述了GC×GC对几种典型食品中挥发性风味成分的分离能力，该技术明显优于传统的1D-GC分离，能减少复杂基质的干扰，解决在1D-GC中共洗脱而被错误识别的情况。此外，越来越多的分析测试技术更趋向于样品预处理与检测仪器的完美结合，如顶空采样模式(静态顶空、动态顶空)、固相微萃取(SPME)、高分辨质谱等均可轻松地与GC×GC分析仪器能实现完美结合，更有利于这项目技术在食品的品质评价、产品定位、掺假鉴别、工艺控制等领域发挥作用。