焦炉工外周血IFN-γ表达及其DNA甲基化的分析

赵慧 高艳荣 宋统球 贾玉巧

014060包头医学院公共卫生学院，内蒙古包头

焦炭制造过程中产生的焦炉逸散物(COEs)成分复杂，其中COEs中的多环芳烃(PAHs)已被国际癌症研究署(IARC)列为人类确定致癌物，PAHs是一类有毒化合物，有致癌性[1,2]。根据流行病学研究，PAHs与免疫功能受损有关，同时PAHs暴露还会增加肺癌发病风险[3，4]。位于人12号染色体的IFN-γ由淋巴细胞产生，具有抗细菌感染、增强免疫应答及抗肿瘤作用[5]。苯并[a]芘(BaP)是PAHs中重要致癌物，Yanagisawa研究发现鼻内接触带有螨虫过敏原的BaP可诱导脾细胞培养上清液产生IFN-γ细胞因子[6]。Al-Daghri研究结果显示哮喘患儿IFN-γ mRNA表达和血清PAH水平有显著相关性[7]。IFN-γ是重要的抗肿瘤免疫细胞因子，Wakita实验表明缺陷IFN-γ的小鼠，鳞状细胞癌发生率显著升高[8]。免疫系统在肿瘤发展中起重要作用。PAHs致癌过程中引起DNA甲基化已被证实在肿瘤中是非常重要的表观遗传[9]，但是PAHs职业接触细胞因子DNA甲基化未有报道。本次实验研究了解焦炉工职业PAHs暴露与外周血血清IFN-γ表达关系及IFN-γ表观遗传机制在多环芳烃暴露损伤中的表现。

资料与方法

选择包头某焦化厂炼焦车间85名工人为暴露组，同厂不接触COEs的辅助车间及行政部门人员47名为对照组。所有研究对象均为男性，汉族，年龄18～60周岁。无明确的心血管、肝、肾、肺及自身免疫等疾病，无滥用药物史，自愿按照要求参加体检项目者。暴露组至少在炼焦车间工作1年以上，对照组工龄满1年且在过去3个月内没有接触过COEs。采集暴露组班后尿及对照组工人晨尿30 mL，紫色EDTA抗凝、橘黄色促凝采血管各采集血液标本3 mL。均-80℃存储，待分析。本研究经包头医学院医学伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意。

问卷调查：调查员统一培训后进行问卷调查，调查表依据职业健康体检表结构进行制作。调查表内容包括个人信息、职业史、既往史以及家族史。吸烟定义为1支/d，且连续1年以上，饮酒为2次/周，连续半年以上。

主要仪器和试剂：HPLC装置及色谱工作站、反相C18色谱柱A1260型荧光检测器(Agilent Technologies公司，美国)；酶标仪(Synergy/HT，美国伯腾仪器有限公司)；MassARRAY Analyzer 4.0质谱仪(Agena， Inc)； 99.8%1-OHP 标 准品、99%咔唑标准品(Dr.Ehrenstorfer，GmbH德国)；人γ干扰素ELISA试剂盒、人尿肌酐ELISA试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)；全血DNA提取试剂盒。

方法：采用碱水解-高效液相色谱荧光法检测尿1-羟基芘(1-OHPyr)水平[10]。用ELISA法检测尿肌酐含量校正尿1-OHPyr数值。标准校准曲线具有良好的线性(r=0.999 1)。检测限：尿样加标确定仪器(3倍信噪比)检测限0.01 ng/L。精密度为日间相对标准偏差2.31%～4.44%。准确度是尿样加标回收率96%～110%。采用ELISA法检测血清中IFN-γ的表达。严格按试剂盒说明书要求操作。采用DNA提取试剂盒抽提DNA后将样本委托博淼生物科技(北京)有限公司采用飞行时间质谱进行DNA甲基化检测。

统计学分析：全部数据资料采用EXCEL录入，用SPSS 22.0进行统计学分析。检验水准α=0.05，连续性变量资料符合正态分布用t检验，方差分析；定性资料用χ2检验；使用协方差分析校正年龄、工龄、吸烟与饮酒；相关性分析采用多元线性回归方法。

结 果

基本资料统计分析：暴露组和对照组间比较，吸烟史和饮酒史差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

各组尿1-羟基芘浓度与外周血IFN-γ的表达：暴露组与对照组间，尿1-OHPyr浓度差异有统计学意义(P＜0.05)，且暴露组1-OHPyr浓度高于对照组。炉侧、炉顶两工种尿1-OHPyr浓度与对照组差异有统计学意义(P＜0.05)。暴露组中焦炉工血清IFN-γ水平低于对照组(P＜0.05)，炉顶工明显高于炉底工(P＜0.05)，3个工种与对照组差异有统计学意义，见表2。

IFN-γ启动子区DNA甲基化分析：分析IFN-γ7个CpG位点，只有CpG-5有统计学意义，暴露组甲基化率高于对照组，见表3。IFN-γ基因质谱分析的屏幕截图可见CPG-5颜色由深变浅，见图1。

各变量间的相关性分析：采用多元线性回归分析，IFN-γ为应变量，其余为自变量。IFN-γ CPG-5甲基化率与IFN-γ含量呈负相关，尿1-OHPyr与IFN-γCPG-5甲基化率呈正相关，差异有统计学意义(P＜0.05)。只有IFN-γCPG-5甲基化率进入方程差异有统计学意义，常数项69.497，β1=-82.438，见表4。

讨 论

尿1-OHPyr是PAHs暴露的生物标志物[11，12]。本次研究暴露组尿1-OHPyr浓度显著高于对照组，说明焦炉工工作场所PAHs暴露高于对照人群工作环境，其中炉侧工、炉顶工PAHs暴露相对较高。建议有关部门做好炼焦工艺改善和焦炉工个体防护，重点防护炉侧与炉顶的工人，并且定期进行职业健康体检。PAHs是免疫抑制类物质，长期暴露引起免疫功能受损，IFN-γ是重要的抗肿瘤免疫细胞因子[13]。本次研究焦炉工外周血IFN-γ含量低于对照组，提示职业性PAHs暴露可降低IFN-γ表达。DNA甲基化是重要的表观遗传，越来越多的证据证明了肿瘤抑制基因的高甲基化和表观遗传沉默的存在[14]。研究表明，儿童暴露于空气污染物中DNA甲基化发生了改变[15]。Tang研究将Jurkat T细胞和两种肺癌细胞系暴露于不同浓度BaP，引起IFN-γ启动子区甲基化与IFN-γ表达水平改变[16]。结合本研究结果，IFN-γCPG-5甲基化率暴露组高于对照组，而且IFN-γ与IFN-γ CPG-5甲基化率呈负相关，IFN-γCPG-5甲基化率与1-OHPyr正相关，证实了IFN-γ与IFN-γCPG-5同职业性PAHs暴露有关联，为更深入研究职业性PAHs暴露引起细胞因子表观遗传改变提供依据。

表1 两组一般情况比较()

表1 两组一般情况比较()

变量 暴露组 对照组 t/χ2 P n %n%年龄(岁) 85 40.72±7.32 47 39.60±8.72 t∶0.787 0.433工龄(年) 85 19.46±8.12 47 19.26±8.94 t∶0.133 0.895吸烟 是 37 43.5 9 19.1 χ2=7.924 0.005否 48 56.5 38 80.9饮酒 是 33 38.8 8 17.0 χ2=6.718 0.010否 52 61.2 39 83.0

表2 尿1-OHPyr与外周血IFN-γ在暴露组中不同工种与对照组间相互比较()

表2 尿1-OHPyr与外周血IFN-γ在暴露组中不同工种与对照组间相互比较()

注：与对照组比较，⋆P＜0.05；与炉底比较，#P＜0.05。

组别 n 1-OHPyr(μmol/mol Cr) IFN-γ(ng/L)暴露组 85 4.47±2.37 41.01±20.40炉侧 29 5.28±2.42⋆ 48.42±17.16⋆炉顶 32 4.14±2.16⋆ 45.23±23.41⋆#炉底 24 3.93±2.41 26.43±10.34⋆对照组 47 2.63±1.46 73.00±26.07 F⋆ 12.446 46.379 P⋆ 0.001 ＜0.001

表3 IFN-γ基因启动子区各位点甲基化水平分析()

表3 IFN-γ基因启动子区各位点甲基化水平分析()

CPG 暴露组(n=18) 对照组(n=15) P CPG-1 0.77±0.22 0.82±0.10 0.433 CPG-2 0.86±0.07 0.87±0.09 0.774 CPG-3 0.78±0.08 0.77±0.10 0.687 CPG-4 0.85±0.07 0.82±0.08 0.329 CPG-5 0.52±0.18 0.33±0.22 0.011 CPG-6 0.80±0.07 0.78±0.06 0.328 CPG-7 0.71±0.36 0.64±0.43 0.645平均甲基化率 0.76±0.21 0.72±0.26 0.191

图1 IFN-γ基因质谱分析图

表4 各变量间相关系数矩阵及检验结果