富血小板血浆用于兔半月板损伤修复的研究

董鑫，陈北北

（1.沈阳医学院，辽宁沈阳110034；2.沈阳医学院附属中心医院，辽宁沈阳110024）

曾经，半月板被认为是“无功能残留物”，随着运动医学的发展，研究不断深入，半月板的功能逐渐被认识，它不再是膝关节内无功能残留物。当然，治疗方法也从手术切除变为力争修复损伤的半月板。近年来医学技术的飞速进步使得部分较重的半月板损伤可以通过外科关节镜手术进行缝合，但更需要一种可以促进半月板损伤修复的办法。目前关于半月板损伤修复的研究中有应用富血小板血浆（Platelet-Rich plasma，PRP）、骨髓间充质干细胞、基质金属蛋白酶和基因转染等多种促进组织修复与再生的治疗办法和假说。相比其他，PRP 的制备来源于自体，其产生过敏反应和传播传染性疾病的可能性比较低。近年间PRP 在多个领域的使用没有明显的相关并发症的报道。其制备有相对简单、快捷、安全、价格低廉等特点。几种体外实验支持PRP 增强半月板纤维软骨细胞愈合的能力，Hong Suk Kwak，Delos Demetris，Ishida Kazunari 等的研究[1-4]持此观点。但是，体内实验中，PRP 对半月板白区损伤的疗效尚存在争议，然而Shin Kyun Ho 等[5]在兔对照试验的结果未显示单次注射对兔内侧半月板水平裂损伤愈合有促进作用。将PRP 单次注射到半月板，不能有效地提高半月板水平裂损伤的愈合。PRP 可作为治疗早期疼痛的方法。也不乏个别病例支持PRP 促进半月板修复，Betancourt JP 等[6]报道一个案例，创伤性半月板损伤患者经过PRP 治疗后，在每次随访评估中疼痛症状（VAS 评分） 有明显改善；Urzen Jessica 等[7]报道了一例43 岁男性病例，在确诊后7个月内接受了三次在半月板内和周围注射富血小板血浆；Pujol Nicolas 通过添加PRP，临床结果略有改善[8]。实验中激活剂的比例和干预频率则无统一标准，恰是经过激活后的血小板包含的α颗粒释放出众多功能强大的细胞因子[9，10]，细胞因子通过影响细胞的再生、成熟及分化等过程从而参与了组织的修复[11-13]。不同血小板活化剂的选择可以显著地影响血小板活化，导致释放的血小板源性生长因子的浓度和各种因子所占组分有所不同，持续释放因子的水平和释放速度受到活化剂的影响[14]。但是，由不同比例激活剂激活的PRP 对愈合能力影响的报道甚少。戴静等报道PRP 与激活剂以9∶1 比例制备的PRP 凝胶促角膜基质细胞增殖作用最强，同时具有有序网状结构和良好的组织黏附性及相容性，是一种可以用于角膜基质再生的良好支架[15]。既然目前关于富血小板血浆的激活方式及比例、应用方式、应用频率还没有一个统一的标准，本实验设计，即通过将富血小板血浆凝胶（PRG）制备时的激活比例和应用时的干预频率作为施加变量，观察富血小板血浆对半月板损伤修复效果的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2017年9月-2018年3月实验于沈阳医学院附属中心医院中心实验室、实验动物手术室及实验动物中心完成。

实验动物：Ⅰ期实验54 只成年健康同种同龄大白兔、Ⅱ期实验48 只成年健康同种同龄大白兔，均由沈阳市于洪区王兵养殖场提供，于实验动物中心饲养，体重2.5～3.0 kg，雌雄不限。实验过程善待动物，参考国家科学技术部于2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

实验试剂：HE 染色试剂盒，10%无菌氯化钙溶液，牛凝血酶1 000 U。

1.2 实验方法

1.2.1 分组

进行初步编号后，采取电脑随机分组。Ⅰ期实验按照富血小板血浆凝胶制备时的激活比例3∶1，5∶1，7∶1 分为A，B，C 三组，每组18 只，并进行编号。Ⅱ期实验按照仅1 次、每周1 次、每2 周1 次、每4 周1 次的干预频率分为A，B，C，D 四组，每组12只，进行编号。

1.2.2 富血小板血浆制备

制备PRP 采取对血小板影响相对较小的Landenberg 法[16]，将装有兔血的离心管对称放入离心机中，以200 g 离心力下离心10 min，液体分为上清液和红细胞两层，交界处有一薄层，肉眼不易看出，即富血小板层（PRP）。保留全部上清液及交界面以下1～2 mm 的红细胞，去除底层含红细胞的液体。再次以200 g 离心力下离心10 min，此时血小板被浓集至离心管底部；再去除管内上层的乏血小板血浆（Platelet-poor plasma，PPP）大部分，约占上清液上3/4，剩余液体各约0.3 mL，摇匀，即为PRP。用1 mL 注射器通过长针头吸出并备用，通常每3 mL 全血制成PRP 约0.3 mL。PRP 凝胶（PRG）的制备是通过向PRP 中加入激活剂后6～10 s 即可形成PRP 凝胶（PRG）。分别用装有0.3 mL PRP 的1 mL 注射器，抽吸0.06 mL 激活剂和少许空气后震动摇匀（以5:1为例）。

1.2.3 建立动物实验模型

双膝建模，麻醉后内侧入路切开内侧副韧带长2.0cm 弧形切口，沿髌骨内侧上缘至胫骨结节处切开皮肤及皮下各层，用预弯的半月板拉钩显露内侧半月板前角、体部及股骨髁软骨面。用尖刀片于内侧半月板游离缘体部造成一个长0.6 cm 统一的无血运区纵行全层裂伤模型。术后以3/0 尼龙线紧密缝合关节囊，肌注青霉素60 万单位预防感染。

1.2.4 实验方法

Ⅰ期实验：A 组右膝关节为实验组，于关节腔内注射激活比例为3∶1 的自体富血小板血浆凝胶，左膝关节不做特殊处理为空白对照组；B 组右膝关节为实验组，于关节腔内注射激活比例为5∶1 的自体富血小板血浆凝胶，左膝关节不做特殊处理为空白对照组；C 组右膝关节为实验组，于关节腔内注射激活比例为7∶1 的自体富血小板血浆凝胶，左膝关节不做特殊处理为空白对照组；各组皆用自制夹板固定膝关节2 周。

Ⅱ期实验：A 组右膝关节为实验组，于关节腔内注射激活比例为Ⅰ期实验最佳比例的自体富血小板血浆凝胶，仅1 次注射，左膝关节不做特殊处理为空白对照组；B 组右膝关节为实验组，于关节腔内注射激活比例为Ⅰ期实验最佳比例的自体富血小板血浆凝胶，每周注射1 次，左膝关节不做特殊处理为空白对照组；C 组右膝关节为实验组，于关节腔内注射激活比例为Ⅰ期实验最佳比例的自体富血小板血浆凝胶，每2 周注射1 次，左膝关节不做特殊处理为空白对照组；D 组右膝关节为实验组，于关节腔内注射激活比例为Ⅰ期实验最佳比例的自体富血小板血浆凝胶，每4 周注射1 次，左膝关节不做特殊处理为空白对照组。皆用自制夹板固定膝关节2 周。

1.2.5 实验标本观察

Ⅰ期实验：分别于术后4，8，12 周，以空气栓塞法每组处死6 只实验动物，取双膝半月板编号后进行大体标本愈合情况和大体形态观察。将实验标本用10%甲醛固定液固定、洗涤、脱钙、脱水、透明、透蜡、包埋等步骤制成石蜡切片，经苏木精-伊红染色，普通光学显微镜观察微观结构，评估愈合情况。

1.2.6 统计学方法

应用SPSS 22.0 统计学软件进行分析，各组之间愈合效果评价属等级资料，组间比较采用Kruskal-Wallis 秩和检验。α=0.05 为检验水准，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物数据分析

Ⅰ期实验动物54 只，Ⅱ期实验动物48 只均无意外死亡，数据无丢失。

2.2 Ⅰ期实验半月板大体观察

4周：A 组，实验组：可见损伤区创缘毛糙；对照组：可见损伤区创缘整齐。B 组，实验组：可见损伤区创缘毛糙；对照组：可见损伤区创缘整齐。C 组，实验组：可见损伤区创缘毛糙；对照组：可见损伤区创缘整齐。

8周：A 组，实验组：可见损伤区创缘处有少许机化凝块；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。B 组，实验组：可见损伤区创缘有机化组织编织，少许相连接；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。C 组，实验组：可见损伤区创缘处有机化组织编织，少许相连接；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。

12周：A 组，实验组：可见损伤区创缘处有大量机化凝块，部分连接；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。B 组，实验组：可见损伤区创缘有机化的纤维组织连接，尚未完全相连；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。C 组，实验组：可见损伤区创缘处有机化的纤维组织连接，尚未完全连接；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。

2.3 Ⅰ期实验12周半月板HE染色镜下观察

A组，实验组：损伤区创缘内有胶原纤维填充，相互编织连接，但填充组织中无纤维软骨细胞或软骨陷窝形成；对照组：损伤区创缘整齐，局部无纤维组织增生，无幼稚成纤维细胞。B 组，实验组：损伤区创缘内有大量胶原纤维填充，基本相互连接，其中伴有少量纤维软骨细胞或软骨陷窝形成，不完全愈合；对照组：损伤区创缘整齐，局部无纤维组织增生，无幼稚成纤维细胞。C 组，实验组：损伤区创缘内有大量胶原纤维填充，基本相互连接，多数其中伴有少量纤维软骨细胞或软骨陷窝形成，不完全愈合；对照组：损伤区创缘整齐，局部无纤维组织增生，无幼稚成纤维细胞（图1-6）。

从表1 等级资料经秩和检验可见，A，B，C 对照组间无差异，各组内实验组与对照组间愈合情况不同，P＜0.001 有统计学意义。A，B，C 实验组间比较，P＜0.025，按α=0.05 的检验水准，可以认为各实验组间对愈合的影响存在差异。A，B，C 实验组间两两比较，C 组优于B 组和A 组，P＜0.05。但A，B 两组比较，P＞0.05 无统计学意义。说明7:1 比例激活剂激活的富血小板血浆凝胶的促进半月板白区损伤修复的效果优于其他激活比例，各实验组与对照组比较，证明各比例激活剂激活的富血小板血浆凝胶均可不同程度地促进半月板白区损伤修复。

图1 A组实验组（HE×100）

图2 A组对照组（HE×100）

图3 B组实验组（HE×100）

图4 B组对照组（HE×100）

图5 C组实验组（HE×100）

图6 C组对照组（HE×100）

表1 Ⅰ期实验12 周各组半月板镜下愈合等级评价表

2.4 Ⅱ期实验半月板大体观察

8周：A 组，实验组：可见损伤区创缘处有机化组织编织，少许相连接；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。B 组，实验组：可见损伤区创缘处有大量机化凝块，部分连接；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。C组，实验组：可见损伤区创缘处有机化组织编织，少许相连接；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。D 组，实验组：可见损伤区创缘处有大量机化凝块，部分连接；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。

12周：A 组，实验组：可见损伤区创缘处有机化纤维组织连接，尚未完全相连；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。B 组，实验组：可见损伤区创缘处有机化纤维组织连接，尚未完全相连；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。C 组，实验组：可见损伤区创缘处有纤维组织连接较紧密，基本完全连接；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。D 组，实验组：可见损伤区创缘处有大量纤维组织填充，尚未完全连接；对照组：可见损伤区创缘欠整齐。

2.5 Ⅱ期实验12周半月板HE染色镜下观察

A组，实验组：损伤区创缘内有大量胶原纤维填充，基本相互连接，多数其中伴有少量纤维软骨细胞或软骨陷窝形成，不完全愈合；对照组：损伤区创缘整齐，局部无纤维组织增生，无幼稚成纤维细胞。B组，实验组：损伤区创缘内有大量胶原纤维填充，基本相互连接，多数其中伴有少量纤维软骨细胞或软骨陷窝形成，不完全愈合；对照组：损伤区创缘整齐，局部无纤维组织增生，无幼稚成纤维细胞。C 组，实验组：损伤区创缘内有大量胶原纤维填充，基本相互连接中有少量纤维软骨细胞或软骨陷窝形成，不完全愈合；对照组：损伤区创缘整齐，局部无纤维组织增生，无幼稚成纤维细胞。D 组，对照组：损伤区创缘内有大量胶原纤维填充，基本相互连接，多数其中伴有少量纤维软骨细胞或软骨陷窝形成，不完全愈合；对照组：损伤区创缘整齐，局部无纤维组织增生，无幼稚成纤维细胞（图7-14）。

图7 A组实验组（HE×100）

图8 A组对照组（HE×100）

图9 B组实验组（HE×100）

图10 B组对照组（HE×100）

图11 C组实验组（HE×100）

图12 C组对照组（HE×100）

图13 D组实验组（HE×100）

图14 D组对照组（HE×100）

从表2 等级资料经秩和检验可见，A，B，C，D 对照组间差异无统计学意义，各组内实验组与对照组之间愈合情况不同，P＜0.001 差异有统计学意义。A，B，C，D 各实验组组间无差异，P＞0.05，按α=0.05的检验水准，不能认为各实验组之间对愈合的影响存在差异。虽然C 组主观观察愈合情况似乎优于A组，D 组优于B 组，但本实验不能说明，在每两周1次的干预频率下，富血小板血浆凝胶的促进半月板白区损伤修复的效果优于其他干预频率。

表2 Ⅱ期实验12 周各组半月板镜下愈合等级评价表

2.6 备注

拟定镜下愈合等级评价：Ⅰ级：损伤区创缘整齐，局部无纤维组织增生，无幼稚成纤维细胞。Ⅱ级：损伤区创缘有新生胶原纤维，创缘旁可见软骨细胞密度增大。Ⅲ级：损伤区创缘内有胶原纤维填充，相互编织连接，但填充组织中无纤维软骨细胞或软骨陷窝形成。Ⅳ级：损伤区创缘内有大量胶原纤维填充，基本相互连接中有少量纤维软骨细胞或软骨陷窝形成，不完全愈合。Ⅴ级：损伤区切片显示，不能辨认创缘，纤维软骨分布均匀，完全愈合。

3 讨论

富血小板血浆是一种相对安全、来源广泛、制备简便的制剂，并且被广泛用于组织修复的研究，在PRP 肌肉、肌腱、韧带、创面修复以及骨组织损伤的修复方面有作用或良好研究前景。冯光等应用改良方法制备PRP 并应用于烧伤创面，具有损伤小、治疗时间短、不易复发，安全可靠等优点。糖尿病足亦有应用[18]。Egemen Ayhan 等[19]在膝关节腔注射PRP 治疗骨性关节炎，得出PRP 有望缓解疼痛、改善膝关节功能和生活质量的结论，特别对年轻患者和轻度骨性关节炎患者。

半月板的血液供应主要局限在外侧1/3，来源有半月板前后角的韧带滑膜套，血管网由周围关节囊及滑膜进入半月板上下表面的薄滑膜血管翳和周边滑膜缘，但无新生毛细血管长入半月板组织中。所以半月板内侧1/3，被称为白区的无血运区，损伤难以修复。近年来，富血小板血浆用于半月板修复的研究日趋火热，经过大量体外实验证明其可以促进半月板纤维软骨修复，但体内实验的结果却不如体外实验那样让人满意。对于富血小板血浆的激活方式及比例、应用方式、应用频率都没有一个统一的标准。期待当富血小板血浆以最佳的激活方式及应用方式通过最佳的应用频率用于半月板损伤修复时，会有令人满意的疗效。

通过本实验得出结论，7:1 比例激活剂激活的富血小板血浆凝胶可能更适合促进半月板白区损伤的修复。但本实验不能证明在不同干预频率下的富血小板血浆凝胶促进半月板白区损伤修复效果的差异，每2 周1 次的干预频率组愈合情况直观上看似乎优于其他各组，但差异无统计学意义。可能由于样本量偏小，尚存在偏倚。另外，损伤修复并没有达到完全愈合，其修复以纤维修复为主，纤维软骨细胞修复不多，其可促进组织修复的生物效能毋庸置疑，导致体内和体外实验结果差别的原因，可能是血小板源性生长因子在体内代谢情况及关节活动影响了组织的修复结果。据最新文献报道，同种异体半月板移植术后联合膝关节腔注射PRP，可以在术后1年内更有效地减轻术后疼痛,改善患膝功能。但其他评价未见统计学明显差异[20，21]。所以，对于PRP 用于半月板修复的应用方式、剂型、应用频率等方案仍需改进，需要做更多的实验去探索。

总而言之，富血小板血浆修复半月板损伤的临床研究仍任重道远，推广应用前仍需大量临床数据，明确其生物学效能，完善其制备方式和应用方法的统一标准。本实验结果由于样本数量原因或许较为局限，但希望能够为富血小板血浆用于组织修复研究提供一些参考。