血管生成素2在乙肝后肝硬化患者血清中的水平及临床意义

汤娜娜,王晓燕,张石玉,赵成光,蒋波,赵海燕,朱季军

乙型肝炎病毒感染所致的慢性肝病是危害我国人民群众健康的重要公共卫生问题[1-3]。慢性肝病的进展主要包括了机体的炎症反应及其修复过程，该过程可导致肝血管生成、肝脏的纤维化、肝硬化，甚至肝癌[4]。肝纤维化的特征是由细胞外基质代替肝细胞，特别是细胞外基质蛋白和胶原，会导致肝脏结构和功能的紊乱[5]。血管生成素2(Angiopoietin-2, Ang-2)是一类内皮生长因子的家族成员，其功能主要参与病理性血管损伤与重建[6]。近年有报道Ang-2参与丙型肝炎后肝脏纤维化的发生发展，但是在乙肝后肝硬化中尚未见报道。本研究将探讨Ang-2在乙肝后肝硬化患者血清中的水平及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取宿迁市第一人民医院2016年1月至2018年8月收治的92例乙肝后肝硬化患者作为肝硬化组，另选取同期宿迁市第一人民医院门诊体检健康的志愿者92例作为健康对照组。肝硬化组，男67例，女25例，平均年龄(47.5±8.1)岁；肝硬化程度：代偿期肝硬化33例、失代偿期肝硬化59例；Child-Pugh分级：A级33例、B级40例、C级19例。健康对照组，男67例、女25例，平均年龄(46.7±7.9)岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会审核通过，纳入的研究对象均了解本研究目的，自愿签订知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准

符合2015版慢性乙型肝炎防治指南中相关诊断标准[7-8]的乙肝后肝硬化患者；或肝脏生化相关指标无异常，既往无肝病病史，无其他系统性疾病及恶性肿瘤的健康志愿者。

1.2.2 排除标准

①其它原因造成的肝损或肝硬化；②近2周内有服用可能影响肝功能药物者；③妊娠期妇女；④疑似或确诊的恶性肿瘤患者；⑤既往或现有大量饮酒史。

1.3 实验方法

1.3.1 血清样本收集

住院病人入院后，或门诊体检人员，清晨空腹，抽取外周静脉血约10 mL，进行离心10 min(3 200 r/min)，取上清，存于干燥管中，并置于-20 ℃冰箱中备用。

1.3.2 Ang-2含量测定

取冷存血清标本约2.0 mL，室温下解冻，取ELISA试剂盒(SEA009Hu，USCN，中国武汉)冻干粉溶解制备标准品，选用酶联免疫吸附试验法测定血清中Ang-2含量，实验步骤按照试剂盒说明书操作。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 Ang-2水平比较

肝硬化组血清中Ang-2水平为(5 962.8±2 227.5)pg/mL，显著高于健康对照组的(3 590.1±1 483.1)pg/mL，差异有统计学意义(t=8.505，P<0.001)。在肝硬化患者中，失代偿期患者Ang-2水平为(7 340.6±1 411.0)pg/mL，显著高于肝硬化代偿期患者的(3 499.6±862.6)pg/mL，差异有统计学意义(t=14.203，P<0.001)，见图1。另外根据Child分级将肝硬化患者分为3组，可以看到随着分级提高，血清中的Ang-2水平明显上升(两两比较P值均< 0.001)。

A：健康对照组(n=92)vs. 肝硬化组(n =92)；B：肝硬化代偿期(n =33)vs. 肝硬化失代偿(n =59)；C：Child分级A级(n =33)vs. B级(n =40)vs. C级(n =19)

2.2 血清Ang-2水平与肝纤四项指标相关性

纳入研究对象血清中Ang-2蛋白的含量与肝脏纤维化指标[层粘连蛋白(LN)、透明质酸酶(HA)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)及Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)]呈显著相关性(P均<0.001)，见表1。

表1 184例研究对象血清Ang-2含量与肝脏纤维四项相关性分析

2.3 不同血清Ang-2水平患者肝硬化比率比较

将所有研究对象(即健康人群和肝硬化人群)按Ang-2含量排序(从低到高)进行三等分组(T1，n=61；T2，n=61；T3，n=62)，分析其肝硬化患者的百分比。随着Ang-2水平的提高，肝硬化患者的百分比亦升高(T1-T3，24.6%、44.3%、80.6%，P< 0.001及linear-by-linear association,P<0.001)，见图2。

图2 不同血清Ang-2水平患者肝硬化比率比较

2.4 Ang-2含量判断肝硬化的ROC曲线

采用入院时血清中Ang-2含量判断纳入研究对象是否患有乙肝后肝硬化，制作ROC曲线，显示AUC为0.795(95% CI, 0.732-0.859)，P<0.001，见图3。根据Youden index判断，最佳敏感度为0.522，特异度为1.000，其最佳界值为5 965.5 pg/mL。

图3 Ang-2判断乙肝后肝硬化的ROC曲线

3 讨论

血管生成素是一类作用于血管内皮细胞的调节蛋白家族，包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4[6]。其通过识别酪氨酸激酶-2受体(Tie-2)，在炎症所致的血管重构及肿瘤血管生成和增长中发挥重要作用[9]。Ang-1被认为是Tie-2的活化配体，而Ang-2由于与Ang-1高度同源，以相似亲和力与Tie-2结合，因此被看做是Tie-2的拮抗剂[9-10]。Ang-2在血管重构的组织中由活化的内皮细胞分泌，可通过拮抗Ang-1来促进血管生成。在血管重建活动较弱的静止组织中，Ang-2水平较低。而在炎症和血管活跃生成的组织中，Ang-2的表达量会显著增加[10-11]。

肝脏活检病理是对肝脏慢性病进行诊断和分期的金标准[11-13]。但是活检评价肝脏纤维化一方面受到取样区域的选择以及病理医生主观的影响，另一方面由于其有创性及潜在的并发症的约束，并不适合长期监测评估慢性肝病患者的病程，无法对患者临床治疗管理提供动态的依据[14-16]。

慢性肝病病程中的肝纤维化和肝硬化往往与肝内病理性血管生成密切相关[17-18]。既往研究证实，肝硬化的进展体现在血管密度的提高和相关血管生长因子高表达[18-19]。西班牙的科学家近年发现：Ang2与丙肝后肝纤维化进程相关，对肝硬化分期具有良好的特异性和敏感性，可作为一项潜在的检测肝纤维化进程的生物标记物[19-20]。

本研究发现，与健康人群相比，乙肝后肝硬化患者血清中Ang-2水平明显升高；与肝硬化代偿期患者相比，失代偿期患者Ang-2明显上升；同时，随着肝功能Child分级提高，血清中的Ang-2也显著增加。但是，同时我们也发现，Child A级患者血清的Ang-2水平与健康人群并无差异。因此，Ang-2可能并不适合用于区别健康人群与肝硬化代偿期患者。此外，Ang-2还与肝脏纤维指标HA、PC-III以及C-IV呈正相关。在本研究纳入研究对象中，血清中Ang-2含量越高，其患有肝硬化的概率越高。最后，ROC曲线下受试者工作曲线显示，Ang-2具有良好的判断肝硬化的能力，其最佳界值为5 965.5 pg/mL，敏感度为0.522，特异度为1.000。

本研究也尚有一些不足：①未纳入慢性乙肝但无肝硬化的患者；②样本量较少，仍需多中心大样本的研究进一步验证；③未来的研究中纳入其它原因造成的肝损患者，如自身免疫性肝病或丙型肝炎等。

本研究第一次报道了Ang-2在乙肝后肝硬化中的水平变化，Ang-2或可作为乙肝后肝硬化的生物标记物，特别是应用于判断肝硬化失代偿期患者；与健康人群鉴别时显示出较好的特异度。