基于网络药理学探讨朱日亨滴丸治疗冠心病的分子机制*

慕桂娟，陆景坤，王跃武，孙雨辉，那生桑，孙宇鑫，胡玉崇

(1.内蒙古自治区包头市中心医院药械科，包头 014000；2.内蒙古医科大学基础医学院，呼和浩特 010059；3.内蒙古医科大学新药临床前安全性评价中心，呼和浩特 010059；4.内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010059； 5.内蒙古医科大学蒙医药研究院，呼和浩特 010059；6.内蒙古自治区乌兰察布市察后右旗中心医院信息科，乌兰察布 012400；7.内蒙古自治区人民医院，呼和浩特 010059)

朱日亨滴丸处方源于临床验方，临床上用于治疗冠心病、“心刺痛”，疗效显著。朱日亨滴丸(曾用名朱日很滴丸)由广枣、肉豆蔻、檀香、栀子、沉香等多味药材组成，选药组方基于蒙医治疗心刺痛理法：方中广枣性味甘、酸而平；效重、腻。性味与效能镇“赫依”，作为君药。肉豆蔻性味辛而温，主镇司命“赫依”为臣药。再加檀香性寒，清博热，组成檀香三味主治心热、心血热。辅以止痛、清血热沉香、栀子等药材，具有清心火、活血化瘀、改善心功能的功效；用于心慌、气短、胸闷烦躁。在临床上用来治疗冠心病、心绞痛等均有很好的疗效。朱日亨组方中各单味药多含有心血管系统药效活性成分。例如广枣中的黄酮、有机酸、酚酸能够减轻心肌缺血-再灌注损伤[1]；酚酸成分没食子酸能够通过调节分裂素活化蛋白激酶9(mitogen-activated protein kinase 9，JNK2)和分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，ERK)磷酸化抑制小鼠心肌肥厚和纤维化[2]；鞣花酸可以减轻大鼠全脑缺血/再灌损伤，对高血压大鼠的心血管损伤有保护作用[3]；黄酮类成分儿茶素能够通过Akt/mTOR途径抑制神经胶质细胞自噬和凋亡[4]。肉豆蔻挥发油成分能够明显减慢心率，降低心律失常的发生率[5]；肉豆蔻中四氢呋喃类木脂素愈创木素和machilin A 能活化AMPK，治疗二型糖尿病等代谢综合征；二芳基丁烷类木脂素肉豆蔻木酚素能活化MAPK，发挥抗炎作用；苯并四氢呋喃类木脂素Myrisfrageal A和B、licarin A 能抑制一氧化碳，发挥抗炎作用[6]。网络药理学其所强调的整体性与系统性和传统医药整体观与辩证论治不谋而合，近年来，网络药理学已经成功运用于六味地黄丸、四物汤、复方丹参等经典方剂的机制、配伍等研究中[7]。因此，本实验采用网络药理学方法初步探讨蒙药方剂朱日亨滴丸治疗冠心病的分子作用机制和潜在活性成分。

1 方法

1.1朱日亨滴丸的化合物收集 文献挖掘，中医药资料库@Taiwan(http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/index.php)和Therapeutic Targets Database(TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/TTD_HOME.asp)数据库检索收集整理朱日亨滴丸中广枣、肉豆蔻、檀香中化学成分，中医药资料库@Taiwan收集检索沉香、阿魏等药材的化学成分，如有糖苷类化合物脱葡萄糖基变为苷元，所有化合物经中药系统药理学资料和分析平台(TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)进行口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug similarity，DL)分析(TCMSP 网站标准：OB≥30%；DL≥0.18)，或Lipinski类药五原则分析，收集筛选朱日亨滴丸候选化合物。

1.2“化合物-靶点-冠心病相关基因”关联的建立 经ChemBioOffice2011软件将候选化合物转化成MDL sdf.格式文件或 MOL2格式文件，上传至PharmMapper数据库(http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/)进行靶点预测，通过反向药效团匹配方法，搜寻潜在药物靶点，预测化合物的生物活性。检索UniProt数据库(http：//www.uniprot.org/)，输入UniProt编号将蛋白校正为官方名称，根据上述的数据库检索与转化，获得相关的蛋白信息。借助冠心病网络药理学研究平台CHD@ZJU V2.0(http：//pharminfo.zju.edu.cn/chd)和OMIM数据库(http：//omim.org/)收集有文献报道与冠心病发病机制相关的基因，进行化合物靶点和冠心病相关基因比对，得到朱日亨滴丸与冠心病机制相关的靶点网络。

1.3通路获取与分析 将通过Pharmmapper获取的靶点导入MAS3.0(http：//bioinfo.capitalbio.com/mas3/)，条件选择：Homo sapiens(Human)；Molecule Type：Protein；Database Symbols：UniProtKB；Functions：Gene，mRNA，Protein，GO，Pathway，CoregulatedGene，Disease，Interaction；Regulation Threshold：Up 2.0，Down 0.5。在提交得到的结果中，选择pathway中的KEGG数据进行通路注释与分析，并得到相关的信息。

1.4构建朱日亨滴丸的“化合物-靶点-通路”网络模型 根据上述化学成分的靶点预测结果，应用cytoscape3.5.0软件构建“化合物-靶点-通路”网络。通过网络分析，研究朱日亨滴丸的多靶点作用及其潜在治疗作用的特异性。

1.5构建朱日亨滴丸的“化合物-靶点-药物”网络模型 查询Drugbank(https：//www.drugbank.ca/)和TTD数据库，依据ATC分类(http：//www.drugbank.ca/atc)获得所有美国食品药品管理局(FDA)批准的治疗冠心病的小分子西药及其靶点信息。利用pharmmapper获得的靶点与西药的共靶信息，构建“化合物-靶点-药物”的关联网络，该关联网络包括朱日亨滴丸、治疗冠心病的西药、预测靶点和西药共有的靶点。然后，利用已知作用机制的西药在该网络中分析朱日亨滴丸治疗冠心病的可能机制。

2 结果

2.1朱日亨滴丸活性成分的潜在靶点信息 应用Pharmmapper在线预测朱日亨滴丸化合物的靶点，通过冠心病相关靶点与Pharmmapper得到的靶点结果进行比对，得到朱日亨滴丸化合物预测靶点与冠心病机制匹配的靶点共85个(总频次为1044)，频次为10次以上的靶点见表1，共38个靶点，频次为671次，占总频次的64.3%。

2.2朱日亨滴丸化学成分潜在靶点的通路富集 将朱日亨滴丸化学成分的所有预测靶点应用MAS 3.0在线工具进行KEGG通路注释，得到相关通路87条(P<0.01)，其中与心血管疾病相关的有43条，前10条见表2。其中与信号转导相关的为3条，包括VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)、ErbB信号通路(ErbB signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)；与细胞进程相关的为3条，包括黏着斑(focal adhesion)、黏附连接(adherens junction)、肌动蛋白细胞骨架调节(regulation of actin cytoskeleton)；与内分泌系统相关的为2条，包括胰岛素信号通路(insulin signaling pathway)、PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)；与免疫系统相关的为2条，包括Fc & RI信号通路(Fc epsilon RI signaling pathway)、T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)；结果表明朱日亨滴丸可能通过调节信号转导、细胞进程、内分泌、免疫、代谢等多个途径发挥治疗冠心病的作用。

2.3朱日亨滴丸“化合物-靶点-通路”网络模型 采用Cytoscape软件建立朱日亨滴丸“化合物-靶点-通路”网络模型，化合物、靶点以及通路结果的关联关系直观地呈现于图1。通过网络拓扑学分析朱日亨滴丸分子与靶蛋白的D-T 网络特征，如网络度、介数[8]。网络模型分析发现，高网络度化合物往往有较高的介数，而这些具有较高介数和网络度的靶点提示可能在生物网络系统中发挥重要作用。

表1朱日亨滴丸化学成分的潜在靶点(频次≥10)

Tab.1PotentialtargetofchemicalcomponentofZhuRihengdroppill(frequency≥10)

名称靶点频次酪氨酸蛋白磷酸酯酶非受体1型PTPN187视黄酸受体RXR-αRXRA70维生素D3受体VDR67醛糖还原酶AKR1B150双特异性有丝分裂激活蛋白激酶1MAP2K149糖皮质激素受体NR3C146雄激素受体AR41热休克蛋白 HSP 90-αHSP90AA141性激素结合球蛋白SHBG40促分裂原活化蛋白激酶 14MAPK14393-磷酸肌醇依赖蛋白酶1PDPK139血清白蛋白ALB37凝血素F227脂肪酸结合蛋白FABP327基质溶素-1MMP323cAMP特异性 3',5'-环磷酸二酯酶 4DPDE4D23中性白细胞弹性蛋白酶ELANE22细胞周期素-A2CCNA221肽基-脯氨酰顺反异构酶FKBP1A20血管内皮生长因子受体 2KDR20组织蛋白酶 KCTSK18半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3CASP314cAMP-依赖蛋白激酶催化亚基 αPRKACA13原癌基因酪氨酸蛋白激酶SrcSRC13二肽基肽酶Ⅳ DPP412雌激素受体βESR212

表2朱日亨滴丸潜在靶点富集与冠心病相关的通路

Tab.2EnrichedpathwaysofpotentialtargetassociatedwithcoronaryheartdiseaseforZhuRihengdroppill

通路分类p-值黏着斑细胞过程2.90×10-19胰岛素通路内分泌系统5.49×10-18VEGF通路信号传导3.87×10-17Fc & RI通路免疫系统1.16×10-13T 细胞受体通路免疫系统1.58×10-13ErbB 通路信号传导3.48×10-13PPAR通路内分泌系统1.19×10-12粘附连接细胞过程4.16×10-12MAPK 通路信号传导4.36×10-12肌动蛋白细胞骨架调节细胞过程5.72×10-10

2.4网络拓扑学分析 网络拓扑学分析结果见图1。结果显示PTPN1、RXRA、MAP2K1、MAPK14、PDPK1在靶点中介数最高；VEGF信号通路、胰岛素信号通路、MAPK信号通路、黏着斑、粘附连接、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路在通路中影响最显著；广枣的脂肪酸类2-isopropylmalic acid(gz1)介数排序第一，其次为肉豆蔻的苯丙素类p-cymene(rb7)和二芳基丁烷类木脂素myrislignan(rx6)；排序在前面的20个化合物有16个化合物为基础方中广枣、肉豆蔻、檀香的化合物，三味药材各占1/3。广枣、肉豆蔻、檀香的化合物平均介数值分别为0.004 766，0.003 635，0.003 525，均高于其他药材化合物平均介数(0.001 307 2～0.002 925 3之间)，以上结果充分证明广枣、肉豆蔻、檀香在朱日亨滴丸的组方配比中占主要位置。朱日亨滴丸与冠心病相关靶点网络度大于10的见表3；朱日亨滴丸化合物中介数大于0.007的重点化合物见表4。

*1节点大小代表“网络度”大小，节点颜色代表节点的“介数”高低，暖色代表高，冷色代表低

图1朱日亨滴丸“化合物-靶点-通路”网络模型

*1The node size represents the value of “network degree”；the node colour represents “betweenness”；warm colour represents high degree and cool colour represents low degree

Fig.1Networkmodelof“compound-target-pathway”ofZhuRihengdroppill

2.5朱日亨滴丸主要活性成分的潜在靶点-冠心病药物关联网络分析 基于朱日亨滴丸和已知治疗冠心病的西药的共靶信息，构建朱日亨滴丸作用靶点-药物关联网络，见图2。朱日亨滴丸与西药有11个共同靶点，靶点分别为NR3C1、NR3C2、PDE4D、PDE4B、PROCR、PPARG、F2、ACE、HMGCR、MMP2、NQO1。涉及到肾素-血管紧张素系统药物、抗血栓药、钙通道阻滞剂、周围血管保护剂、调血脂药和其他类等共55个治疗冠心病的西药。其中，肾素-血管紧张素系统药物的靶点为ACE、MMP2、PPARG；抗血栓药的靶点为PDE4D、PDE4B、PROCR、F2、NQO1；钙通道阻滞剂的靶点为NR3C2；周围血管保护剂的靶点为NR3C1、PDE4B；调血脂药的靶点为PPARG、HMGCR。结果进一步说明，朱日亨滴丸是通过抗凝、调节激素分泌、影响肾素-血管紧张素系统、调脂等发挥治疗冠心病的作用。

表3朱日亨滴丸冠心病关键靶点的(网络度≥10)网络拓扑学参数

Tab.3NetworktopologyparametersofkeytargetsassociatedwithcoronaryheartdiseaseforZhuRihengdroppill(degree≥10)

靶点介数度PTPN10.250 162 2866RXRA0.169 345 9652MAP2K10.162 111 1351MAPK140.113 866 5038PDPK10.095 717 4233F20.044 716 8822PDE4D0.033 267 2721FABP30.031 222 4819CCNA20.032 142 1118靶点介数度KDR0.036 416 4616SRC0.019 978 5315AKT10.017 613 1815MAPK10.007 825 9414CASP30.028 233 2914RAC10.007 704 0512GSK3B0.011 097 2411RAF10.004 664 9911

表4朱日亨滴丸重点化合物(介数≥0.007)的网络拓扑学参数

Tab.4NetworktopologyparametersofkeycompoundsofZhuRihengpill(betweenness≥0.007)

编码化合物介数度gz12-isopropylmalic acid0.020 234 797rb7 对伞花烃(p-cymene)0.018 124 388rx6肉豆蔻木脂素(myrislignan)0.016 555 826aw10密叶辛木素(confertifolin)0.013 682 054tq4表洛柯皂苷元(16-episarpagine)0.013 462 436tb16β-檀香醇(beta-santalol)0.012 554 325rz7肉豆蔻木酚素(macelignan)0.010 916 485rt3γ-萜品烯(γ-terpinene)0.010 650 876CX1(+)-guaia-1(10),11-dien-9-one0.010 419 945gq15-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural)0.009 960 196gf33,3’ -二甲基鞣花酸(3,3’ -dimethyl ellagic 0.009 111 265 acid)tb21α-檀香醇(alpha-santalol)0.008 708 335gf5bis[(2S)-2-ethylhexyl]benzene-1,2-dicarboxy-0.008 593 325 latert10β-水芹烯(β-phellandrene)0.008 590 015CX2(+)-methyl selina-4,11-dien-14-oate0.008 024 135ts3富贵草碱(terminaline)0.007 968 115tb27檀油酸(teresantalic acid)0.007 597 295gf11原儿茶酸(protocatechuic acid)0.007 242 124CX131,6-dihydroxy-2,4-dimethoxyanthranquinone V0.007 108 025tb6檀烯酮(santenone)0.007 009 345

*1节点大小代表“网络度”大小，节点颜色代表节点的“介数”高低，暖色代表高，冷色代表低

图2朱日亨滴丸作用靶点-西药关联网络

*1The node size represents the value of “network degree”；the node colour represents “betweenness”；warm colour represents high degree and cool colour represents low degree

Fig.2CorrelativenetworkofthetargetsbetweenZhuRihengdroppillandwesternmedicine

3 讨论

网络药理学对化合物群预测的靶点基因进行信号通路富集得到的通路能反应该化合物群组对相关疾病的作用机制。通路富集结果提示朱日亨滴丸对冠心病、心肌缺血的治疗作用与影响应激反应(胰岛素信号通路(主要为RISK信号通路)、MAPK信号通路、ErbB信号通路、mTOR信号通路)，动脉粥样斑块的行成(细胞粘附，粘附连接)，斑块不稳定性(VEGF信号通路)，血管内皮损伤(细胞粘附，粘附连接，PPAR信号通路)，免疫与炎症反应(Fc&RI途径、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、自然杀伤细胞细胞毒活性、PPAR信号途径)，脂代谢(PPAR信号途径、脂肪因子信号途径)密切相关。

在网络中，高介数的节点称为瓶颈节点、高连接度的节点称为网络的枢纽，这些拓扑学属性都能反应节点在网络中的重要性[8-9]。朱日亨滴丸网络拓扑学及生物学功能分析表明，综合排序靠前的PTPN1、RXRA、PDPK1、MAPK14等10个靶点很有可能是朱日亨滴丸治疗心血管病的主要靶点，这些靶点多为应激反应、血管内皮损伤、炎症等信号通路的关键基因，朱日亨滴丸主要活性成分与治疗冠心病的肾素-血管紧张素系统药物、抗血栓药、钙通道阻滞剂、周围血管保护剂、调血脂药等均存在共靶，进一步说明朱日亨滴丸治疗冠心病、心肌缺血是通过多靶点、多途径发挥作用。化合物节点的网络拓扑学分析结果表明，介数及网络度排序在前面的20个化合物有16个化合物为基础方中广枣、肉豆蔻、檀香的化合物，三味药材各占1/3。其平均介数值均高于其他药材化合物平均介数，其中，广枣的平均介数最高，以上结果充分证明广枣的君药地位，广枣、肉豆蔻、檀香在朱日亨滴丸的组方配比中占主要位置。排序靠前的化合物可以作为物质基础的重点探究对象进一步实验验证。

冠心病发展过程中涉及的炎症、脂代谢、动脉粥样硬化、氧化应激等病理过程，对朱日亨治疗冠心病的网络药理学验证及机制探讨需建立不同模型进行分析； 尚需要通过进一步基因、蛋白表达的检测，物质基础与分子靶点间的关系尚需进一步单体成分的药效学研究。