黄粉虫主要活性物质的提取研究进展

李宁，冉学文，熊晓莉

(重庆工商大学 重庆市特色农产品加工储运工程技术研究中心，重庆 400067)

黄粉虫是一种人工养殖的资源昆虫，其营养价值丰富，体内含多种营养物质，不仅可作为饲料，还可用于制作高质量的蛋白食品[1]。以黄粉虫幼虫(干基)为例：含蛋白质多达48%～55%，脂肪27%～30%、碳水化合物10%～12%，尚含有维生素、激素、酶及无机盐磷、铁、钾、钠、钙、铁、锌、硒、镁、铜、锰等，营养价值很高[2-3]。除此之外，黄粉虫还含有对人体有特殊作用的几丁质[4]、抗菌肽[5]、凝集素[6]等多种功能活性物质，可改善人的记忆能力、抗疲劳、抗组织缺氧、延缓衰老、降血压、缓解贫血等功能[2，6-7]，在食品、医疗保健、特种养殖、生物柴油等领域具有较好的应用前景[8-12]。目前，关于黄粉虫体内活性物质的提取、分离、纯化及应用的研究并不多。本文综述了黄粉虫体内的降血压肽、抗菌肽、抗氧化肽、黄酮等具有生物活性物质的提取、分离及纯化工艺，以及这些活性物质在食品保健领域的应用前景，为黄粉虫的规模化、资源化利用提供参考。

1 活性物质提取

1.1 多肽

1.1.1 降血压肽 高血压为常见的心血管疾病，并会引起严重的并发症。目前，临床常用的抗高血压药主要有利尿剂、β-受体阻滞剂、钙离子通道阻滞剂、血管紧张素Ⅱ-受体拮抗剂等[13]。以上药物降压效果明显，但同时具有过度降压、皮肤过敏、疲乏等副作用，而从天然产物中获得的降血压肽因其降血压效果明显，毒副作用低、安全、有效，已成为目前研究的热点[14]。降血压肽是一种血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，通过抑制ACE的活性实现降低血压的目的。研究证实，末端为疏水性氨基酸，更有利于与ACE结合[15]。因黄粉虫体内含有较多的疏水性氨基酸，故黄粉虫可作为提取ACE抑制剂的原料[16-17]。

目前，从黄粉虫体内获得降血压肽，主要是通过酶法，该法具有以下优点：反应条件温和，副反应少，选择性强、无需高温高压设备等优点。酶解过程大致如下：筛选酶、酶水解、酶灭活、粗分离、浓缩、纯化、干燥。常用到的酶有Alcalase碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶等中的一种或几种。

以黄粉虫蛋白粉为原料，经木瓜蛋白酶酶解，经单因素和优化实验后，得出最优的工艺条件：70 g/L底物浓度，1%加酶量，于pH 6.5、55 ℃下反应7 h。所得产物的ACE抑制率达58.86%[15]。

以脱脂黄粉虫幼虫蛋白粉为原料，在以下条件下酶解，可获得对ACE抑制作用较强的酶解产物：Alcalase酶，3%蛋白粉，加酶量4 000 U/g蛋白粉，pH 8.5、50 ℃反应，20%水解度，此时获得的酶解液，其对ACE的IC50值为0.39 g/L[18]。研究进一步证实，水解过程中施加超声波处理可以加快水解速率。短时间超声波处理(5 min内)可使Alcalase活性增强，但长时间超声波处理会降低其活性。黄粉虫幼虫在酶解过程中会伴随大量色素物质生成，导致酶解液为棕黄色，需进行脱色处理。实验表明，3%粉末活性炭用量在pH 3、40 ℃下吸附50 min，黄粉虫幼虫降血压肽酶解液脱色率达85.3%，脱色后的水解液对ACE的抑制率达70.8%[19]。

1.1.2 抗菌肽 抗菌肽是一类小分子多肽类物质，广泛存在于自然界的生物体中，具有分子量小、热稳定、广谱抗菌、水溶性好等特点，在医药、水产与畜禽养殖、种植、食品等领域有良好的应用前景，近年来是国内外的研究热点[20]。

黄粉虫受刺激或被感染后引起免疫应答反应会产生抗菌肽，其数量和抗菌效果受诱导方法、虫态、诱导时间、诱导次数、外源刺激物种类、外源刺激物的强度(浓度)等因素的影响。黄粉虫抗菌肽种类多，不同的诱导和分离方法可获得不同的抗菌肽。因此，从虫体中提取、分离、纯化仍然是抗菌肽研究的基础和重要组成部分。

索相敏等[21]采用毛细管提取法提取黄粉虫抗菌肽：将消毒后的黄粉虫，剪去其一对足，用毛细管收集其血淋巴。将血淋巴于低温离心后，将上清液透析，再次离心，获得抗菌肽含量较高的上清液。该法取出时未加其他溶剂，减少污染和分离难度，但黄粉虫个体较小，要得到大量的抗菌肽很困难。故一般采用全虫液氮速冻、高速匀浆后加入合适的缓冲液提取。

以0.1%三氟乙酸作为提取液，经粗提、Sephadex-G50预纯化、Sephadex Peptide凝胶柱再纯化、Resource 15RPC反相柱纯化后，产物抗菌活性较粗提物明显增强，可能是匀浆法中，抗菌肽所占的比例太小，使其不能发挥作用[22]。从以上分析也可以看出，抗菌肽的成分复杂，用匀浆法提取分离的步骤冗长，收率不高。

王小平等[23]将诱导分离后的抗菌肽，用于测试对9种动物病原细菌和10种植物病原细菌的抑菌效果，结果见表1。

表1 黄粉虫抗菌肽对病原细菌的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of Tenebrio molitor antibacterial peptide on pathogenic bacteria

由表1可知，黄粉虫抗菌肽虽然具有广谱抗菌性，但不是对每种菌都有效。当然，这也可能与诱导条件、提取分离条件、抑菌测试条件、抑菌浓度等因素有关，如王立新等制备的黄粉虫抗菌肽，对金黄色葡萄球菌的抑制效果优于对大肠杆菌的抑制效果[24]。程璟侠[25]用超声诱导黄粉虫后，提取分离了其体内的抗菌肽，并从这些抗菌物质中，分离出活性最强的一种抗菌肽作为K562癌细胞的抑制剂，以羟基脲为对照组。实验证实，抗菌肽对K562细胞增殖抑制效果明显高于对照组。抗菌肽使大量的细胞阻滞在G1期(DNA合成前期)，抑制了S期DNA合成，说明抗菌肽可通过影响细胞周期来发挥抗K562细胞的作用。

目前，天然抗菌肽仍存在以下问题：①抗菌活力和抗菌谱和传统抗生素相比仍显不足；②用法用量不清：其毒理性和药理药效方面的研究还需深入；③尚不能规模化生产：因生物体中天然抗菌肽含量很低，提取工艺繁琐，得率不高；抗菌肽的天然结构及活性难以维持，这些大大限制了其大规模应用。当然，抗菌肽有自身的特点及优势，随着研究不断深入，仍有望成为一种新型生物制剂[26]。

1.1.4 抗冻多肽 抗冻多肽(蛋白)可以非依数性地降低溶液的冰点，而不影响溶液的熔点，在食品、药品冰冻、贮藏、运输和解冻过程中能抑制重结晶，并能减少滴液。Ramsay等[30-31]率先在黄粉虫幼虫体内发现了具有凝固点抑制活性的蛋白(FPDP)。后来的研究人员从黄粉虫体内分离得到了较纯的FPDP，大致分离过程如下：将处于-1 ℃下黑暗环境中2周的黄粉虫幼虫，在50%乙醇2次匀浆，离心取上清液。用不同的Sephadex离子交换树脂吸附蛋白质，然后以NaCl溶液洗提，洗提液通过超滤膜浓缩，浓缩液再通过SephadexG50凝胶过滤、离子交换色谱脱盐、等电聚焦等作用后，得到纯度较高的FPDP[32]。现有研究表明，在相同浓度下，黄粉虫抗冻蛋白的热滞活性是一般鱼类抗冻蛋白的10倍～100倍。Graham等[32]从黄粉虫幼虫中分离的抗冻蛋白在1 mg/L的浓度下可以达到5.5 ℃的热滞活性，其抗冻活性是鱼类的数倍甚至上百倍，富含半胱氨酸、苏氨酸，相对分子量8 400。目前抗冻蛋白市场售价很高，限制了抗冻蛋白在商品中的应用。

1.2 黄酮

汪璇[33]以脱脂黄粉虫粉为原料，在超声波辅助下提取黄粉虫黄酮，优化的提取条件为：虫粉∶水=1∶18 g/mL，适当的超声提取条件(30 min、58 ℃、功率380 W)，得到粗黄酮(CF)提取量为11.47 mg/g黄粉虫。然后用XDA-1型大孔吸附树脂对粗黄酮进行精制，获得最佳分离条件：上样液1.0 g/L，pH 5，2 BV/h 吸附流速、2 BV样量；洗脱2 BV/h、60%乙醇、3 BV洗脱液体积，经纯化后，黄酮纯度由3.74%提高到16.34%，得到精制黄酮(PF)。

1.3 酶

1.3.1 纤维素酶 纤维素酶可对纤维素分子进行降解，是一类具有特定催化功能的活性蛋白质。冰浴条件下解剖出黄粉虫的肠道，按虫重和溶液体积比1∶1加入0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，冰浴匀浆后，迅速在4 ℃、15 000 r/min条件下离心10 min，取上清液为纤维素酶的粗酶液，经检测，在黄粉虫幼虫肠道内发现了2种纤维素消化酶：内切-β-1，4-葡聚糖酶(Endo-1，4-β-D-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)[34]。

1.3.3 乙酰胆碱酯酶 乙酰胆碱酯酶(AChE)可使神经递质乙酰胆碱在完成神经兴奋的传递后尽快降解，以维持生物体内的神经冲动正常传递，是神经传导过程中的一种关键酶。取黄粉虫幼虫胸部(头部)，按1∶10 g/mL比例加入磷酸钠盐缓冲液，匀浆。4 ℃下，将匀浆液离心30 min，得粗酶液。将粗酶液过层析柱精制(SephadexG-200、洗脱液为磷酸钠盐缓冲液，洗脱12 h)，得到纯化倍数18.84的AChE。研究还表明，黄粉虫体内占总活性75%左右的AChE主要集中在其胸部和头部，幼虫相应部位的活性明显低于成虫[36]。

1.3.4 超氧化歧化酶 超氧化歧化酶(SOD)是一类源于生命体的活性物质，能催化超氧阴离子发生歧化反应，消除新陈代谢中产生的一些有害物质，具有抗衰老、调节机体代谢、抑制心脑血管疾病、抗肿瘤、增强免疫力等功能，在医药、日用化工、保健食品等领域是一种重要的添加剂。原料不同，SOD的制备方法不同。目前，提取SOD的主要原料为动物血、植物组织、微生物。吴蕾等[37]报道了黄粉虫中SOD的提取、纯化方法。取黄粉虫干粉，与磷酸钠缓冲液一起研磨，冷冻离心，收集上清液，用(NH4)2SO4沉淀杂蛋白，冷冻离心，得上清液。再次将沉淀溶解于上述磷酸盐缓冲液，静置离心，弃去沉淀，透析、脱盐、浓缩得到纯化的SOD，经鉴定为Cu-Zn-SOD。

1.4 抗凝集素

血栓性疾病是近年来威胁人类健康的最严重疾病之一，目前临床多以抗凝、溶栓药及抗血小板等药物防治。由于传统药物的局限性，凝血因子Xa抑制剂成为了研究的热点[38]。Lee等[6]将冻干的黄粉虫的幼虫，用含有1%醋酸的乙醇溶液回流，然后将粗提物悬浮在水中，然后依次用正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯提取，将乙酸乙酯提取物部分用色谱进行分离，可得到具有抗血栓和抗血小板凝集作用的化合物L-脯氨酰-L-酪氨酰和N-乙酰酪胺，这些化合物有望成为一种预防或治疗血管性疾病的药物。

1.5 壳多糖

壳多糖在医疗保健、食品添加剂、植物生长调节剂、环境保护等方面具有良好的应用价值[39-40]。从黄粉虫提取壳多糖，具有原料来源稳定、含量丰富、产品灰分含量低、提取条件相对温和等优势，提取的方法主要有酸碱法、酶法、微生物法[39-42]。课题组将黄粉虫壳聚糖，加入少量稀酸和过氧化氢混合液，置于50 ℃恒温处理5 h，经中和、醇沉、离心后，收集沉淀，干燥，即可得到水溶性的壳多糖。研究证实，制得的水溶性壳多糖，对大肠杆菌具有很好的抑制作用，具有成膜作用，可用于果蔬保鲜、医疗保健、消毒等方面。将水溶性壳多糖用于鲜切苹果的保鲜实验中，可使苹果的褐变、重量损失率和硬度相对于对照组分别降低66.8%，19.7%和39.3%，有机酸损失不明显，保鲜效果优于壳聚糖和其他保鲜剂[43-45]。

2 展望

黄粉虫作为一种潜在的资源，因具有容易获得、蛋白质含量高、营养结构合理、加工特性良、活性物质高等优点而引起了广泛的关注。黄粉虫集多种功效于一体的活性物质于一身，这在天然食物、药物资源类物质中并不多见。黄粉虫养殖虽然有多年的历史，但对黄粉虫的研究还仅停留于较初级阶段，对其体内活性物质种类、提取工艺、成本控制、应用领域等问题，尚有很多亟待解决的问题，实现对黄粉虫大规模的工业化应用，仍有较大的研究空间。