油棕细胞悬浮培养及植株再生技术

潘登浪 ，邹积鑫 ，曾宪海 ，林位夫 ，Khengtuan Chean

（1.中国热带农业科学院橡胶研究所/省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室/中国热带农业科学院橡胶研究所热带林木种子种苗工程中心，海南 海口 571701；2.农业农村部油棕种质资源圃/农业农村部儋州热带作物科学观测实验站，海南 儋州 571737）

【研究意义】油棕（Elaeis guineensisJacq.）属棕榈科油棕属植物，是著名的热带木本油料作物，被誉为“世界油王”［1］，是马来西亚、印度尼西亚等国的主要经济作物，也是我国拟重点发展的木本油料作物之一。目前油棕商业种植普遍采用duru和pisifera杂交的F1代种植材料，其个体间产量和农艺性状差异大，其中优异单株可超过杂种平均产量的30%［2-3］或以上。而这些优异油棕单株是基因杂合体，其杂交后代遗传性状难以保存亲本优良特性，况且油棕只有一个生长点，无法通过嫁接无性繁育。组织培养是解决优异油棕单株大量种苗繁育的有效途径，但油棕传统固体培养方式的组培技术效率低，为此，人们开展了油棕细胞悬浮培养技术的探索。

【前人研究进展】油棕细胞悬浮培养及其植株再生技术是高效的组培技术体系，其从外植体到量化生产的再生植株可比固体培养技术体系短11 个月［4］。迄今 Touchet等［5］和 Teixeira 等［6］分别报道了2个不同油棕细胞悬浮培养技术体系。Sompong等［7］研究比较了不同细胞分裂素种类（KN和BA）对在悬浮培养中的细胞增殖与叶绿体发育的影响，结果表明低浓度KT促进油棕细胞增殖和叶绿体发育，高浓度KT、6-BA抑制细胞增殖，不利于叶绿体发育。Kramut等［8］报道了不同基本培养基（MS和Y3）、不同生长素种类（NAA、Di、2，4-D）及浓度（0.1～0.5 mg/L）、不同碳源（蔗糖30 g/L、山梨醇36.4 g/L）对悬浮培养细胞增殖的影响。相关研究报道对不同材料公布的技术工艺不同，且未公布如易碎胚性愈伤组织诱导等技术细节，悬浮细胞增殖效、体胚萌芽率等有待进一步提高。国内未见油棕悬浮培养研究报道。【本研究切入点】综合前人研究，主要集中在不同激素浓度及其组合对油棕易碎胚性愈伤组织诱导的影响，不同培养基对油棕体细胞悬浮系增殖与后续体胚发育的影响和体胚植株再生。【拟解决关键问题】本研究以现存我国优良油棕单株嫩叶来源的愈伤组织为外植体，探明其易碎胚性愈伤组织诱导技术，解决易碎胚性愈伤组织诱导率低、胚性悬浮细胞增殖慢等问题，建立油棕胚性细胞悬浮培养及其植株再生技术，为我国优良油棕无性系种植材料高效繁育、细胞生物学研究、生物技术育种研究等提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017—2018年在海南省儋州市新村宝岛中国热带农业科学院橡胶研究所油棕组培实验室进行。以源于RY8成龄油棕树芯叶的瘤状愈伤组织为材料。油棕母树为来源于中国热带农业科学院橡胶研究所为依托单位的农业农村部油棕种质资源圃优良单株，瘤状愈伤组织诱导参照邹积鑫等［9］。

1.2 试验方法

1.2.1 易碎胚性愈伤组织诱导 取瘤状愈伤组织团粒（直径约为3～5 mm），接种到基本培养基为改良WPM，并附加不同质量浓度2,4-D（0.50 、1.00 mg/L）或 2,4-D（0.50 、1.00 mg/L）、麦草畏（0.50 、1.00 mg/L）与德夸霉素（0.10 mg/L）组合的激素培养基，共6个处理。每个处理3次重复，每个重复接种50胚团。培养条件：暗培养，温度28（±2）℃。诱导培养30 d后观察统计易碎胚性愈伤组织诱导率。

1.2.2 悬浮细胞系的建立及其生长特性测量 取1.2.1试验优化培养基中培养的生长旺盛、质地松散的易碎胚性愈伤组织1 g，置于150 mL三角瓶中，并添加30 mL细胞悬浮培养基（培养液配方为优化的培养基去除琼脂），置于往复式摇床上在100 r/min、28（±2）℃、室内自然散射光条件下培养，每7 d继代1次，每次继代时倾去占总体积2/3的上清液，补充新鲜的悬浮培养液至30 mL继续培养，第3次继代培养后，用0.83 mm孔径已灭菌的不锈钢筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过0.83 mm孔径筛网的悬浮细胞继续培养，获得生长状态较均一、分散性好的细胞团即悬浮细胞系。以已建立好的悬浮细胞系为材料，测生长曲线：取上述悬浮细胞系细胞密实体积（PCV）0.5 mL，接种到加有30 mL培养液的150 mL三角瓶中悬浮培养；每2 d取整瓶悬浮液置于离心管（已灭菌）经1 000 r/min离心5 min后，测细胞密实体积（PCV），然后放回三角瓶继续培养，培养14 d共测7次。每个处理3次重复，每个重复3瓶。试验结束后，以测得培养物平均PCV绘制生长曲线。

1.2.3 油棕悬浮细胞系增殖 取已建立好的悬浮细胞系0.2 g接种到基本培养基为改良WPM，并附加1.00 mg/L麦草畏与不同浓度TDZ（0 、0.10 mg/L）、ZT（0.01 、0.05 、0.10 mg/L）、KT（0.10 mg/L）、德夸霉素（0.10、0.30、0.50 mg/L）共9种激素组合（处理）的各培养基中，每种培养基20 mL/瓶, 28（±2）℃、室内自然散射光、100 r/min下悬浮培养14 d，测细胞鲜重。每个处理3次重复，每个重复3瓶。

1.2.4 悬浮细胞系分化与植株再生 取含1.2.3实验中所列各激素组合的各培养基上培养的悬浮细胞系1 mL PVC转到MS+谷氨酰胺100 mg/L +蔗糖30 g/L培养基上，于28（±2）℃，2 000 lx下培养进行胚诱导，每14 d更换新培养基1次，培养60 d观察统计悬浮系分化成大于1 mm的胚团数量。每个处理3次重复，每个重复接种3瓶。将大于1 mm胚团转到无激素MS+谷氨酰胺100 mg/L +蔗糖30g/L固体培养基进一步成熟与萌芽。

采用Microsoft Excel 2007进行数据初步整理和作图，采用SPSS 17.0软件进行数据统计与方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同激素浓度及其组合对易碎胚性愈伤组织诱导的影响

以油棕芯叶瘤状愈伤组织为材料，较低浓度2,4-D、2,4-D或麦草畏与德夸霉素组合可诱导获得油棕易碎胚性愈伤组织（图1）。试验结果（表1）表明，在不同质量浓度2,4-D、2,4-D或麦草畏与德夸霉素组合培养基诱导油棕易碎胚性愈伤组织，其诱导率存在差别；在供试浓度范围内麦草畏比相应浓度的2,4-D对易碎胚性愈伤组织诱导更有利；0.10 mg/L德夸霉素与一定浓度2,4-D或麦草畏组合促进胚性愈伤组织形成。在供试激素组合中，1.00 mg/L麦草畏+0.10 mg/L德跨霉素最适于供试材料诱导易碎胚性愈伤组织，诱导率高达28.67%。

表1 不同激素浓度及其组合对油棕易碎胚性愈伤组织诱导的影响Table 1 Effects of different hormone concentrations and their combinations on the induction of friable embryogenic callus of oil palm

图1 易碎胚性愈伤组织Fig. 1 Frable embryogenic callus

2.2 细胞悬浮培养系的建立

取生长旺盛、质地松散的油棕易碎胚性愈伤组织1 g，置于150 mL三角瓶中，并添加30 mL细胞悬浮培养基（培养液配方为优化的培养基去除琼脂），置于往复式摇床上在100 r/min、28（±2）℃、室内自然散射光条件下培养，每7 d继代1次，每次继代时倾去占总体积2/3的上清液，补充新鲜的悬浮培养液至30mL继续培养，第3次继代培养后，用0.83 mm孔径已灭菌的不锈钢筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过0.83 mm孔径筛网的悬浮细胞继续培养，即获得生长状态较均一、分散性好的细胞团即悬浮细胞系（图2）。

图2 油棕细胞悬浮培养Fig. 2 Cell suspension culture of oil palm

2.3 悬浮细胞系生长特性

从图3可见，油棕胚性悬浮细胞系在转入新培养基后，培养0～6 d悬浮细胞增殖缓慢；培养6～10 d悬浮细胞系处于对数生长期，增殖速度较快；培养10～14 d悬浮细胞系增殖速度延缓。因此悬浮细胞系最佳继代培养周期为14 d左右。

图3 油棕悬浮细胞系生长曲线Fig. 3 Growth curve of oil palm suspension cell line

2.4 不同质量浓度激素及其组合对油棕悬浮细胞系增殖的影响

表2数据表明，添加TDZ、ZT与麦草畏组合的处理，在供试浓度范围内比单独添加麦草畏处理的细胞鲜重增殖率低，说明TDZ和ZT在一定质量浓度范围内抑制麦草畏对悬浮细胞增殖的作用，其中ZT在0.01～0.10 mg/L随质量浓度增加抑制作用增强；适当质量浓度的KT、德夸霉素可增加麦草畏促进悬浮细胞增殖作用，在供试激素组合中0.30 mg/L德夸霉素与1.00 mg/L麦草畏组合质量鲜重增殖倍数最大，达7.23倍。

表2 不同激素组合对油棕悬浮细胞系增殖的影响Table 2 Effects of different hormone concentrations and their combinations on the proliferation of oil palm suspension cell line

2.5 不同质量浓度激素及其组合对油棕悬浮细胞系后续分化的影响

取含表2所列激素组合的各培养基上培养的1 mL PCV悬浮细胞系转到MS+谷氨酰胺100 mg/L +蔗糖30 g/L培养基上，于28（±2）℃、2 000 lx下进行胚诱导培养，探索不同增殖培养基对油棕悬浮细胞系后续体胚发生的影响，每两周更换新培养基1次，培养60 d观察统计悬浮系分化成大于1 mm的胚团数量（图4A，封三）。试验结果（表3）表明，悬浮细胞增殖培养基中的不同激素种类及其质量浓度对细胞团后续培养中胚团分化能力的作用不同，悬浮增殖培养基中一定浓度范围TDZ、ZT、KT、德夸霉素均对后续胚团发育有利，其中0.30 mg/L德夸霉素效果最好（295个/瓶）。

图4 悬浮细胞系体胚发育与植株再生Fig. 4 Somatic embryos development and regeneration of suspension cell line

表3 不同质量浓度激素及其组合对油棕悬浮细胞系后续分化的影响Table 3 Effects of different hormone concentrations and their combinations on the subsequent differentiation of suspension cell lines

2.6 悬浮细胞系分化与植株再生

将大于1 mm胚团转到MS+谷氨酰胺100 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L中，在28（±2）℃、2 000 lx下培养，60 d左右获得成熟胚（图4B，封三），成熟胚在相同新培养基上培养60 d左右萌芽，继续培养60 d左右获得完整植株（图4C，封三），平均诱导率达55%以上。然后转入壮苗培养基（MS+蔗糖3 000 mg/L，pH6.0）中，在28（±）2℃、2 000 lx下进行壮苗培养60 d，达到长出2级根、3张叶片以上完整植株(图4D，封三）。

3 讨论

易碎胚性愈伤组织的获得是建立高效的悬浮培养及植株再生体系的基础与关键，胚性愈伤组织质量决定建立胚性细胞悬浮系的效率和成败。Touchet等［5］用源于成龄油棕树叶片的瘤状愈伤组织首次成功建立了细胞悬浮培养及其植株再生体系，但建立悬浮细胞系需要超过56 d。Teixeira等［6］分别用源于油棕种子胚的易碎胚性愈伤组织和颗粒较大的球形愈伤组织团建细胞悬浮系，前者需60 d获得悬浮液，后者需90～150 d获得悬浮液，而且后者未能实现植株再生。高晗等［10］用楸树易碎胚性愈伤组织建立胚性细胞悬浮系只需15～30 d。张晓丽等［11］描述了其研究获得的3种青天葵愈伤组织，选其中生命力强、颗粒状、疏松易碎的浅黄白色胚性愈伤组织进行种子细胞的培养，约用47 d建立较均一的悬浮细胞系。在Touchet、Teixeira等的科技文献中未见油棕易碎胚性愈伤组织诱导技术细节公布。本研究探索了不同激素及质量浓度对源于成龄油棕叶片愈伤组织诱导易碎胚性愈伤组织的效果，获得了质量良好的易碎胚性愈伤组织，并用该材料建立质量优良的油棕悬浮细胞系只需21 d。

外源激素对植物细胞团或愈伤组织增殖与分化起着重要作用，不同激素对不同物种或不同基因型植物的影响不同。如添加适量的6-BA和TDZ对大豆的子叶节丛生芽的诱导有一定促进作用，但并不能提高苜蓿愈伤的分化能力［12］。对于钙果叶片分化成芽的诱导，细胞激动素的浓度应相对固定，应更多考虑调配生长素如NAA、IAA的质量浓度［13］。2 mg/L 6-BA与 0.5 mg/L NAA 组合，最适于顶花板凳果愈伤组织和芽诱导［14］。TDZ对白鹤芋胚性细胞团增长量的影响也十分明显，在一定质量浓度（0～0.50 mg/L）范围内，无论是单独TDZ，还是与2,4-D组合均促进细胞增殖［15］。本研究中0.1 mg/L TDZ和ZT不利于油棕悬浮细胞团增殖，适当质量浓度KT、德夸霉素促进油棕悬浮细胞团增殖。

德夸霉素又称狭霉素A，我国农业应用上又称为灵发素，具有植物细胞分裂素的生物活性，被视为一种新的植物生长调节剂，已被我国农业科技工作者应用于一些植物组织培养研究中［16］。如许宏源等研究发现灵发素可以促进三七愈伤组织诱导与增殖、体胚发生与成苗［17-18］；许鸿源等［19］利用LFS直接诱导半夏叶柄茎段获得愈伤组织和体胚。陈念平等报道灵发素可以比传统2，4-D更高效率地诱导优质的甘蔗愈伤组织［20］。在本研究中初步发现适当质量浓度德夸霉素协同麦草畏有促进诱导油棕胚性愈伤组织效果和促进悬浮细胞增殖及其体胚发生能力的作用；其对不同基因型油棕培养材料的作用效果如何，单一德夸霉素是否有相同作用等问题，有待进一步研究。

4 结论

本研究以源于成龄油棕芯叶的瘤状愈伤组织为材料，诱导获得易碎胚性愈伤组织，建立了较高质量的细胞悬浮系，并获得再生植株，建立了油棕胚性体细胞悬浮培养及其植株再生技术体系。研究结果初步认为适当质量浓度德夸霉素与2,4-D或麦草畏组合，可促进油棕芯叶愈伤组织形成易碎胚性愈伤组织；用生长旺盛、质地松散的易碎胚性愈伤组织悬浮培养21 d可建立生长状态较均一、分散性好的悬浮细胞系；初步发现含适当质量浓度德夸霉素与麦草畏液体培养基利于油棕悬浮细胞系增殖和后续体胚发育。研究结果可为我国优良油棕无性系种植材料高效繁育、细胞生物学研究、生物技术育种研究等提供参考。