河北唐山地区奶牛早期妊娠诊断技术应用与推广

文/石有权 张进红

（1 河北省滦州市农业农村局；2 河北省唐山市畜牧工作站）

近年来，我国奶牛养殖业正经历着从单纯的规模化、集约化生产方式向标准化、现代化生产方式转变，目前已成为资本、技术双密集型行业。2015—2017年期间，唐山市每年的奶牛存栏量在40 万头以上，居全省前列，是奶牛养殖大市。其中，存栏300 头及以上规模的奶牛场（区）达到了300 多个，奶业一直是唐山市传统优势产业。但与奶牛养殖发达国家及国内发达地区相比，唐山市奶牛饲养管理整体水平差距较大，尤其体现在奶牛早期妊娠诊断方面。

2015—2017 年河北省唐山地区开展奶牛早期妊娠诊断技术推广，本项目所推广的奶牛早期妊娠诊断方法，是通过检测妊娠相关物质——妊娠相关蛋白 （Pregnancy Associated Glycoprotein，PAGs），来判断该牛是否怀孕的一种准确、快速、操作便捷的检测方法。该方法对妊娠第28天及以后的母牛血液中PAGs浓度进行检测和判读，进而判断该母牛是否已经妊娠，该技术具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点。其优势主要体现在以下七大方面：（1）配种后28 天准确判定空怀牛只，及时做出繁殖管理决策；（2）空怀检测准确率高，达到99.9%以上；（3）缩短空怀天数，降低饲料成本，提高繁殖率；（4）尾根静脉采血检测，对牛体伤害小，利于胚胎安全，不会由于早期触摸胚胎发生胚胎损失；（5）可实现大批量检测，不仅适用于小规模养殖场，尤其适宜现代化大型规模化牛场使用；（6）体外操作，大大降低了人畜共患病的感染几率，降低牛只间交叉感染和疫病传播的风险；（7）技术操作误差小，减少繁殖人员的工作强度。

1 奶牛早期妊娠诊断技术要点

1.1 奶牛早期妊娠诊断的操作流程

1.1.1 样品的采集

采集配种后28 天及以上天数的母牛血样，分离血清，以备检测。

1.1.2 试剂准备

（1）在使用之前，所有的试剂必须恢复到18～26 ℃。

（2）应通过轻轻涡旋、旋转混合均匀。（3）移液器和吸头的准备，确保每个样本1 个吸头。

（4）使用蒸馏水或去离子水对浓缩洗涤液进行10 倍稀释（每个反应板条需10 mL浓缩洗涤液加入90 mL水中）。

1.1.3 检测操作

（1）试剂及样品的加入

在所有样品和对照孔内滴加1 滴样品稀释液，确保每个样品1 个吸头。用移液器、吸头吸取阴性对照并分别加入2 个孔内，吸取阳性对照分别加入2 个孔内，吸取样品（血清）并加入适当孔内，轻弹微量反应板，使其反应板中的溶液混匀，盖好盖板，在室温下孵育30 min（可以有误差2 min）。 孵育完成后，移除盖板，快速翻转反应板，将板孔内液体弃入废液缸或水槽，用装有洗涤溶液的洗瓶洗板3～5 次。

（2）检测溶液加入

在每个反应孔中加入2 滴检测溶液，盖好板盖，在室温下孵育30 min（可以有误差2 min），再次进行洗板3～5 次。

（3）酶标抗体加入

在每个反应孔中加入2 滴酶标抗体，盖好板盖，在室温下孵育30 min（可以有误差2 min），再次进行洗板3～5 次。

（4）底物液和终止液加入

在每个反应孔中加入2 滴TMB底物溶液，室温下孵育15 min（可以有误差1 min），此步骤必须避光操作。后在每个反应孔中加入2 滴终止液终止反应。注意：在加终止液时要按加入底物溶液的顺序进行滴加，轻弹微量反应板将反应板中的溶液混匀。

1.1.4 读板及结果判定

动物的妊娠状态是由肉眼观察孔内颜色决定的，若与阳性对照孔呈蓝色的为阳性，与阴性对照孔颜色相似为空怀，如样品孔颜色很难用肉眼分辨，则认为可疑/疑似，推荐妊娠复检。

1.2 试剂盒及相关耗材的储存

试剂储存于2～8 ℃环境条件下。

1.3 检测结果的判断及相应处理

1.3.1 为了保证试验的有效性，阳性对照孔必须变蓝。如果阳性对照孔没有变蓝，试验结果是无效的，则需要根据说明书重新进行试验。

1.3.2 对比样品和阴性对照呈现颜色，如两个孔的颜色难以用肉眼分辨，则被认为可疑或疑似，建议重新采样复检。

1.3.3 检测结果为阴性，则判定该母牛为空怀，但在对该母牛进行下一步处理，尤其是同期发情处理前，应足够慎重，避免出现因本次处理而人为导致的妊娠母牛流产。

1.3.4 在奶牛妊娠早期，胚胎死亡是很常见的现象。而在胚胎死亡的早期，PAGs蛋白会在母牛体内循环。可以在一段时间后重新采样进行妊娠复检，也可采用其他妊娠检测方法确认。生产负责人应与兽医一起制定出适合于本场的繁殖管理程序。

1.4 其他注意事项

严格按照产品使用说明操作，严格按照操作程序进行操作，为了得到较好的试验结果，还应注意以下几点：（1）把所有的生物材料当作潜在的传染源来处理，在处理样品时佩戴防护手套、穿防护服、戴防护眼镜及防护面罩，用过的材料要无害化处理。（2）小心操作，防止试剂盒组分污染。（3）不要使用过期的试剂盒。

2 唐山地区奶牛早期妊娠诊断技术推广应用情况

2.1 开展奶牛养殖情况调查及结果分析

2015年1 月开展了全市奶牛养殖情况调查，包括各主要县市区能繁母牛数、目前采用的妊娠诊断方法、妊娠诊断时间、平均空怀天数、配种期母牛日均采食量和饲料成本等情况。根据调查结果分析，本次共调研规模奶牛场225 个，其中，在妊娠诊断方法方面，217 个场采用直肠触诊（PPR）法，占比96.44%；8 个场采用或结合采用B超法，占比3.56%；没有牛场采取利用早期孕检试剂盒等产品的早期妊娠检测方法。具体调查情况统计如表1。

2.2 多点控制试验示范过程与结果

2015年2 月—9月，试验期8个月，选定3 个养殖场为试验场，滦县兴源奶牛场为实验一场、丰润区建泉奶牛场为实验二场、丰南中奥奶牛场为实验三场，各试验场均采用自繁自育方式，在开展本试验之前，进行了预试验，对该早期妊娠诊断技术的准确率和时效性进行验证。

表1 唐山市奶牛养殖调查统计表

2.2.1 开展预试验，验证该技术的准确性

（1）试验时间、地点及试验动物

2015年2月5 日，在实验一场即滦县兴源奶牛场选出20 头母牛进行预试验，其中，未配种母牛3 头、配种在70 天以上并经直肠触诊确认已妊娠母牛3 头、已经输精28 天待检母牛14 头。（2）试验方法

当天对所有试验母牛进行尾根静脉采血，收集到20 个血液样品，严格按照操作规程及时检测和结果判读；在最后1 次输精后60 天由经验丰富的兽医进行直肠触诊，检查其是否妊娠。

（3）结果与分析

应用“奶牛早期妊娠诊断技术”对20 个样品进行检测，其结果与牧场后期直肠触诊（PPR）方法检测结果对照情况见表2。

由表2可知，检测结果显示为阳性有15 头，阴性有5 头。检测结果为阳性的样品中，05号、15号、20号样品对应的母牛为配种60 天以上并经直肠触诊确认已妊娠母牛，检测结果与实际情况一致；其余13个样品对应的母牛的60 天触诊结果也为妊娠，检测结果与后期验证结果一致。检测结果为阴性的样品中，02号、06号、10号样品对应的母牛为未配种奶牛，检测结果与实际情况一致；08号、17号样品对应的母牛的60天触诊结果也为空怀，检测结果与后期验证结果一致。结论：该技术对配种28 天及以后母牛的妊娠诊断准确率100%；空怀诊断准确率100%。

2.2.2 正式试验

（1）试验时间、地点及试验动物

2015年2 月初开始，在3 个试验场同时开展正式试验。试验对象为全群1～5 胎成母牛。

2014年成母牛配种妊娠、产犊情况作为该试验的对照组，2015年2—8月的配种、妊娠、产犊情况作为试验组。

（2）试验方法

2015年2—9 月，对配种后28～30 天未返情的母牛采集血样送试验室，使用该技术进行妊娠诊断，根据试验室反馈的检测结果由技术人员对检出的空怀牛及时处理，再次诱导排卵，而后进行人工授精，在输精后28 天再次采血检测。对应用该技术前后3 个试验场的奶牛空怀天数变化情况进行统计。

表2 PAGs检测结果与60 天妊娠检测结果对照表

表3 应用该早期妊娠诊断方法前后平均空怀天数对照统计表

（3）数据统计与分析

采用SPSS软件对数据进行分析，P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2.2.3 结果与分析

应用该技术前后3 个试验场奶牛平均空怀天数变化结果见表3。

由表3可见，应用该技术前后，实验一场平均空怀天数分别是156.73 天和134.06 天，减少22.67天，差异极显著（P＜0.01）；实验二场平均空怀天数分别是152.05天和130.25 天，减少21.80 天，差异极显著（P＜0.01）；实验三场平均空怀天数分别是160.53 天和136.05 天，减少24.48 天，差异极显著（P＜0.01）；3 个实验场共统计了1 591 头和1 716 头奶牛，平均空怀天数分别是155.74 天和132.97 天，减少22.77 天，差异极显著（P＜0.01）。

通过应用该技术，3 个试验场平均有效减少奶牛空怀天数22.77 天，降低了饲喂成本，3 个试验场每头牛能够平均累计新增效益=平均有效减少奶牛空怀天数（22.7 天）×每头牛每天的饲料成本（45.5 元/头）-每头牛新增的生产费用（每头牛检测用试剂盒成本平均为35 元/头）=22.77×45.5-35=1 001.04 元。