耳针对血管性痴呆大鼠认知功能及海马神经细胞的影响

乔晓迪，张媛媛，张庆萍，井 杰

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；3.安徽中医药大学针灸推拿学院，安徽 合肥 230012；4.杭州市余杭区第五人民医院，浙江 杭州 311100)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是指由各种脑血管疾病引起的，以记忆、认知功能缺损为主要症状的临床综合征[1]，VD是老年期痴呆的主要类型之一。在导致VD的各种脑血管性疾病中，以缺血性脑血管疾病最为多见，脑内缺血低氧性低灌注可直接或间接损伤海马区神经细胞，引起海马CA1区神经细胞损伤及突触丢失，从而导致学习记忆功能障碍。据流行病学调查，在欧美，VD占老年期痴呆的30%，而在我国则高达60%，且有渐增的趋势。然而，目前尚缺乏可改善VD认知障碍的疗效肯定的药物，因此，探索非药物疗法治疗VD已日益受到国内外学者的重视。本研究选择以治疗持续性更佳的耳针为治疗手段，取大鼠耳穴“心”“肾”“皮质下”，分别在耳针治疗的不同时间节点，动态观察VD大鼠学习记忆成绩、神经行为学评分，并结合治疗前后VD大鼠海马CA1区神经细胞形态变化，探讨耳针治疗VD的作用机制，以期为其临床应用提供进一步的理论和实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 体质量约350 g的健康雄性Wistar大鼠60只，购自南京实验动物中心[(SCXK(苏)2008-0004)]，常规饲养于安徽中医药大学经络研究所实验室动物房。

1.2 药物 尼莫地平片(山西亚宝药业集团股份有限公司)，研磨成粉末并与蒸馏水混合，制成0.01 g/mL的溶液。

1.3 主要试剂与仪器 水合氯醛：上海医药集团有限公司；DTT-2大鼠跳台仪：中国中医科学院；莱卡2135石蜡切片机：安徽电子科学研究所；BM-Ⅱ型病理组织包埋机：安徽电子科学研究所；Olympas PM-20显微照相设备、Olympas BX-51光学显微镜：日本奥林巴斯光学株式会社。

2 方法

2.1 模型复制与分组 采用四血管阻断法[2]复制VD模型，模型复制4 d后，利用跳台实验、神经行为学评分筛选VD模型大鼠30只，采用电脑生成随机数字法将其分为耳针组、西药组、模型组，每组10只。另取10只大鼠设为正常组。

2.2 治疗方法 正常组与模型组不采取治疗措施，常规饲养。①耳针组：取大鼠耳穴“心”“肾”“皮质下”，穴位定位参照华兴邦《大鼠图谱的研制》[3]。采用无菌掀针，将掀针固定留置于所选大鼠耳穴上12 h，每日1次，两耳交替治疗，30 d为1个疗程，共治疗2个疗程，两个疗程之间休息1 d。②西药组：尼莫地平12 mg/kg(相当于60 kg成人临床剂量的6倍)，按20 mL/kg灌胃给药，疗程同耳针组。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 跳台实验 按照金杰等[4]的方法改制跳台仪。大鼠首次跳下平台时间为潜伏期，并记录其5 min内受电击的次数，作为学习记忆成绩数据。模型复制后第4天及治疗第30、60天，均测定各组大鼠学习记忆成绩。

2.3.2 神经行为学评分 模型复制后第4天，对正常组、模型组大鼠进行首次神经行为学评分。以治疗第30天、60天结束后6 h为时间节点，采用6级评分法[5]分别对各组大鼠进行神经行为学评分。0分：无功能障碍；1分：不能伸展前肢；2分：向一侧旋转；3分：向一侧倾倒；4分：无自主活动伴意识抑制；5分：死亡。将评分为1、2、3分的大鼠纳入实验。2.3.3 组织学观察 采用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔麻醉，后断头取脑，经组织脱水，石蜡包埋，以厚度5～8 μm对海马部位连续切片，选取5张相同平面用于苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察，并在400倍光镜下选取海马CA1区3个不重复的视野，用于观察神经细胞形态的变化，分别记录3个视野的完整神经细胞数量，取平均值。

3 结果

3.1 各组大鼠学习记忆成绩、神经行为学评分比较 模型复制后4 d，与正常组比较，VD模型大鼠跳台错误次数和神经行为学评分均明显增加(P<0.05)，跳台潜伏期明显缩短(P<0.05)。结果表明，VD大鼠模型复制成功。见表1。

表1 模型复制后4 d正常组与VD模型大鼠神经行为学评分和学习记忆成绩比较

注：与正常组比较，*P<0.05

治疗30、60 d后，与正常组比较，模型组大鼠神经行为学评分和跳台错误次数均明显增加(P<0.05)，跳台潜伏期明显降低(P<0.05)；与模型组比较，耳针组与西药组大鼠神经行为学评分和跳台错误次数均明显降低(P<0.05)，跳台潜伏期明显增加(P<0.05)；西药组与耳针组上述指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 治疗30、60 d后各组大鼠神经行为学评分和学习记忆成绩比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2 各组大鼠海马CA1区神经细胞形态学变化比较 正常组大鼠海马CA1区神经细胞结构完整，排列密集、整齐，胞浆充足透明，细胞核呈圆形或椭圆形，位置居中，胞核完整的神经细胞数量较多。模型组大鼠海马CA1区神经细胞间距变大，体积变小，排列紊乱，轮廓模糊，可见部分变性、坏死的细胞，细胞核固缩成三角形或形状不规则，胞核完整的神经细胞数量较少。见图1。正常组大鼠海马CA1区锥体细胞(胞核完整的神经细胞)存活数(189.10±10.86，n=10)明显多于模型组(95.10±8.58，n=10)，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明模型组大鼠海马CA1区神经细胞严重变性、坏死，甚至大量丢失。

图1正常组(A)、模型组(B)大鼠海马CA1区神经细胞形态学变化(HE染色，10×40倍)

治疗60 d后耳针组、西药组大鼠海马CA1区神经细胞结构接近正常，排列欠整齐，可见少量散在变性和坏死神经细胞，未见严重变性神经细胞，胞核完整的神经细胞数量较多；模型组大鼠海马CA1区神经细胞形态结构不完整，排列紊乱且稀疏，轮廓较模糊，胞核与胞浆界限不清，细胞间距变大，并见散在变性坏死的神经细胞，胞核完整的神经细胞数量较少。见图2。

注：A.正常组；B.模型组；C.西药组；D.耳针组

图2治疗60 d后各组大鼠海马CA1区锥体细胞形态学比较(HE染色，10×40倍)

与正常组比较，模型组大鼠海马CA1区锥体细胞存活数显著减少(P<0.05)；与模型组比较，耳针组、西药组大鼠海马CA1区锥体细胞存活数显著增多(P<0.05)；耳针组与西药组大鼠海马CA1区锥体细胞存活数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。表明耳针、西药治疗可改善变性的神经细胞，促使其修复和再生，西药与耳针的疗效无明显差异。见表3。

表3 治疗60 d后各组大鼠海马CA1区锥体细胞计数比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

VD属中医学“呆证”“善忘”范畴，其病位在脑，病变涉及五脏，尤与心、肾关系密切。五脏之中，肾藏精生髓，髓汇聚而成脑，且有赖于髓之荣养；脑为元神之府，若肾精衰枯，则无以化生气血，精亏血少，髓海空虚，脑失津液之濡、精髓之养，致灵机、记性皆失。心主血脉，藏神，又为“五脏六腑之大主，精明之所舍也”，为人的精神意识思维活动的主宰，心血耗伤，心神失养则发为呆病。《灵枢·口问》：“耳者，宗脉之所聚也。”全身各大脉络汇聚于耳，且现代耳穴经络感传实验也发现，刺激耳穴可诱发循十二经脉的感传现象，说明耳与全身各脏腑都有着密切的联系，耳既依赖脏腑精气血津液的濡养，亦可反映脏腑出现的病变。现代神经解剖学证实，耳廓神经分布十分丰富，在中枢神经系统各个节段与许多内脏神经纤维发生紧密联系，且刺激耳穴具有抑制神经细胞凋亡，改善脑血流，调和气血的作用[6-7]。故本实验选取耳穴“心”“肾”“皮质下”，均为心、肾、大脑在耳廓的相应功能区。现代医学研究对于痴呆的发病机制尚无统一认识，治疗上也以西药为主。尼莫地平属二氢吡啶类钙通道阻滞剂，属临床常用药之一。诸多临床研究表明其在治疗多种原因造成的卒中后认知障碍中具有确切疗效[8-11]。故本实验选取尼莫地平作为西药组，以期比较耳针与西药的疗效差异，为耳针能否成为西药替代疗法提供理论依据。

海马作为大脑边缘系统的重要组成部分，是调节学习记忆的关键部位。海马CA1区神经细胞对缺血具有选择性敏感，脑缺血缺氧或炎症等损伤易引起海马CA1区神经细胞损伤及突触丢失，胆碱神经细胞的受损，从而使脑内学习记忆的生物学基础的海马环路受损，导致记忆障碍[12-15]。研究表明，耳针可延缓中枢胆碱能神经细胞的受损，减慢其降解过程[16]，抑制神经细胞凋亡，保护缺血后损伤的海马神经细胞[17]，改善脑组织能量代谢,促进损伤脑组织的修复与再生[18]。本实验通过镜下观察VD大鼠海马神经细胞的数量及变性，结果显示与模型组比较，耳针组海马CA1区锥体细胞存活数明显增多，神经细胞结构更加趋于正常，神经细胞排列变整齐，变性神经细胞得到改善，且实验中随着耳针治疗疗程的延长，治疗的不断深入，VD大鼠跳台实验潜伏期不断延长，错误次数不断减少，神经行为学评分不断下降，可知VD大鼠的认知障碍和神经损伤均在不断改善。结果表明针刺耳穴“心”“肾”“皮质下”可改善变性的海马CA1神经细胞，促进其修复与再生，从而提高VD大鼠学习记忆功能，提示这可能是临床耳针治疗VD有效作用的可能机制。

临床治疗VD疗程较长，长期不间断的治疗及药物带来的不良反应使患者往往缺乏依从性，失去治疗信心，不利于VD患者的治疗。耳针作为治疗VD的有效手段之一，尤其是耳穴压丸疗法，具有其独特的优势，不仅临床操作方便，无不良反应，且具有长时间、持续性的治疗效果，可明显减轻患者治疗的时间负担，提高就诊的依从性，有助于增强患者治疗信心。