橡胶树HbHMGS1启动子对光照、干旱及热击处理的表达响应

巩笑笑，闫冰玉，谭玉荣，王 鹏，李双江，王 艺，周璐瑶，刘进平

(海南大学 热带农林学院/海南省热带生物资源可持续利用重点实验室， 海口 570228)

橡胶树(Heveabrasiliensis)作为最主要的产胶植物已在我国海南、云南、广东、广西及福建等地区广泛种植。天然橡胶因其在工业、农业及国防领域的广泛应用，已成为不可或缺的工业原料及战略物资[1-4]。目前，天然橡胶的生物合成已取得较大进展，但是橡胶生物合成的调控机制研究仍然很少[5]。天然橡胶是以异戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP)作为单体聚合形成的聚异戊二烯(cis-1,4,-polyisoprene)[6]。目前认为，在高等植物中IPP通过甲羟戊酸(mevalonic acid,MVA)及甲基赤藓醇四磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)2条途径合成，但早期放射性标记实验证明，天然橡胶生物合成的前体IPP来源于MVA途径[7]。其中，羟甲基戊二酰辅酶A合酶(3-hydroxy-3-methylgutaryl-CoA synthase,HMGS)是橡胶树中参与橡胶生物合成及MVA途径中其他类异戊二烯生物合成的关键酶[8]，橡胶树中编码该酶的基因已被克隆，SUWANMANEE等[9]与SIRINUPONG等[10]先后克隆了该基因家族的2个成员hmgs1和hmgs2，且hmgs1在乳胶细胞的表达量要比叶片中高，hmgs2在乳胶、叶柄及叶片中的mRNA表达量各不同，其中，乳胶中的表达量最高，叶柄次之，叶片中最低。研究表明，HbHMGS基因的cDNA序列与拟南芥和樟子松的cDNA序列相似性分别达到了81%及74%[9]。目前已有研究表明，乙烯利刺激橡胶树后能够显著增加HbHMGS的酶活性[11]，但是尚未见光照、干旱和热击等环境因素对该基因表达调控的报道。启动子是基因编码区上游与基因转录相关的一段非编码DNA序列，并且在基因表达与调控方面起到重要作用[12]。植物启动子根据基因表达调控类型不同可以分为组成型、诱导性及组织特异型启动子几种类型[13]。目前，花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子和nos(胭脂碱合酶)启动子[14]是应用比较广泛的组成型启动子[15]，它能在双子叶转基因植物中高效表达[16]。由于启动子在表达调控方面的重要作用，笔者克隆了橡胶树HbHMGS1基因启动子，并构建与GUS基因融合的植物表达缺失载体，通过农杆菌介导的方法转化烟草和拟南芥进行表达分析，确定了HbHMGS1启动子在T2代转基因拟南芥植株中的组织特异性及对光照、干旱及热击等处理响应表达情况，旨在了解HbHMGS1基因表达模式及其在橡胶生物合成与对非生物胁迫响应中的作用。

1 材料与方法

1.1材料本实验所用的橡胶树叶片取自海南大学试验基地热研7-33-97品系嫁接植株。野生型拟南芥种子哥伦比亚型(col-0)及烟草种子(本生烟)，植物表达载体pCAMBIA1301，农杆菌菌株GV3101均由本实验室保存；LA Taq DNA polymerase(TaKaRa, RR02MB )，限制性内切酶(TaKaRa)，T4DNA连接酶(TaKaRa)均购自大连宝生物公司；质粒DNA提取(OMEGA，D6943-02)和胶回收试剂盒(OMEGA，D2500-02)购自北京智远方杰有限公司；生化试剂购自上海生工，Marker，抗生素及19T载体购自大连宝生物公司。引物合成和基因测序由上海英潍捷基贸易有限公司完成。GUS染液配置：2 mmol·L-1X-GLuc,100 mmol·L-1Na3PO4缓冲液，5 mmol·L-1K3Fe(CN)6,5 mmol·L-1K4Fe(CN)6，10 mmol·L-1EDTA, 0.2% Triton X-100。

植物材料的处理：(1)光照处理：选取2组长势基本一致且健康的T2代转基因拟南芥植株，分别置于持续光照和黑暗条件下进行处理，分别在处理12，24，48，72，96，120和144 h后进行取样。(2)热击与干旱处理：将2组含有6个缺失片段的转基因苗1组放置在37 ℃培养箱(16 h光照/8 h黑暗)中进行热击处理5 h后取样，另外1组置于原来环境中停浇水约10 d后进行取样，各缺失片段转基因拟南芥苗作为对照不进行任何处理。含有CaMV35S启动子的转基因拟南芥植株同时进行以上处理。

1.2HbHMGS1启动子克隆及缺失表达载体的构建以橡胶树叶片为主要材料，采用CTAB法提取基因组DNA。下载NCBI上已发布的橡胶树HbHMGS1基因mRNA序列(GenBank Accession number:AF396829)和橡胶树全基因组数据库[17]进行BLAST比对，获取HbHMGS1启动子序列。利用Primerpremier5软件设计正向引物HbHMGSP-F：CGggatccGCAAACAAGAGGAATGGTTG 及反向引物HbHMGSP-R： CATGccatggTCTCTACGCCTCTCCAATTCC扩增HbHMGS1基因起始密码子ATG上游1 656 bp的序列，在基因的上下游引物中分别引入了BamHI和NcoI酶切位点，进一步构建T载体送测序。以验证正确的包含HbHMGS1启动子质粒DNA为模板，分别在HbHMGS1启动子上游-1290/-1、-1040/-1、-699/-1、-454/-1及-213/-1(ATG)处设计5′缺失特异性引物作为上游引物，反向引物不变，通过PCR扩增HbHMGS1启动子5′侧翼序列各缺失片段。引物序列分别是，D2-cF(-1290/-1)：CGggatccTCCTTAAATTTAAGAGTTTAACGAG；D3-cF(-1040/-1)：CGggatccTGGATGGCTTCTGATTTGGT；D4-cF(-699/-1)：CGggatccGATTCGTGTCGCATGAGGTT；D5-cF(-454/-1)：CGggatccGAAGTGGGCTCCAAAAGATT和D6-cF(-213/-1)：CGggatccTTCTCTCCTTGCTGCTTCCA。PCR产物胶回收后，连接T载经克隆转化后测序验证。将携带HbHMGS1启动子5′各缺失片段的T载体用限制性内切酶BamHI和NcoI进行双酶切，同时用这2个酶对植物表达载体pCAMBIA1301进行双酶切，双酶切产物回收后进行连接转化，构建各缺失片段与GUS基因的融合表达载体，各构建载体分别命名为D1-1656，D2-1290，D3-1040，D4-699，D5-454及D6-213。

1.3生物信息学分析将克隆获得的HbHMGS1启动子序列，通过DNAMAN的生物信息分析软件进行序列比对，利用PlantCARE[18](http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线软件进行分析预测，以期对HbHMGS1启动子的功能进行初步的预测。

1.4农杆菌介导的烟草叶片瞬时转化将构建好的HbHMGS1启动子各缺失片段与GUS融合的植物表达载体通过冻融法转入GV3101农杆菌菌株中，取适量的农杆菌转化子扩大培养至100 mL LB+Rif(25 mg·L-1)+kan(50 mg·L-1)液体培养基中，至OD600值为1.5～2.0，用10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES(pH5.7)和400 μmol·L-1AS(乙酰丁香酮)的无菌溶液悬浮，调整菌液浓度使其OD600值约为2.0，室温静置3 h后用无针头的注射器将悬浮液注射到生长1月左右的烟草叶片背面，28 ℃培养3 d，然后用打孔器取叶片进行GUS染色。

1.5拟南芥转化及转基因植株的鉴定将前期保存的HbHMGS1启动子及其缺失启动子菌液扩大培养到100 mL LB+Rif(25 mg·L-1)+kan(50 mg·L-1)液体培养基中，28 ℃培养至OD600=1.0～1.3；5 000 r·min-1离心10 min后收集农杆菌细胞；配置w=5%蔗糖的侵染液溶解农杆菌沉淀，并调整OD600≈1.0，转化前加φ=0.02%的Silwet L-77，采用浸花法转化拟南芥。剪去长势较好的野生型拟南芥植株的果夹，将未授粉的花序浸没在侵染液中约90 s。待植株成熟后收取T0代转基因拟南芥种子，用φ=70%酒精及w=10%次氯酸钠进行杀菌，最后将种子均匀平铺在含有50 g·L-1潮霉素的MS培养基上进行筛选。将转入HbHMGS1启动子及其他缺失片段的转基因拟南芥T0代种子经潮霉素抗性板筛选后，待其成熟进一步提取T1代转基因拟南芥植株的DNA，以DNA为模板使用特异性引物和GUS引物进行PCR检测。

1.6组织化学染色及GUS活性荧光检测取T2代转基因拟南芥幼苗不同时期和成熟阶段各组织器官进行GUS染色，以X-Gluc为底物，GUS染液浸没材料即可，37 ℃过夜，用70%乙醇脱色后，观察染色结果并拍照。GUS活性的定量分析利用4-MUG作为底物[19-20]。

2 结果与分析

2.1HbHMGS1启动子和其缺失片段克隆以及植物表达载体的构建橡胶树HbHMGS1启动子及5'缺失片段的PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，分别在1 600 bp，1 200 bp，1 000 bp，700 bp，500 bp及250 bp处可见特异性单一的条带，与预期目的条带大小相似(图1A)。进一步进行产物胶回收，连接pMD19T载体后进行测序，测序结果与数据库序列一致。将以上测序验证正确的包含HbHMGS1启动子及5′各缺失片段的T载体酶切后进一步构建与GUS基因的融合植物表达载体。对目的表达载体进行双酶切验证，1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1B所示，分别在1 600 bp，1 200 bp，1 000 bp，700 bp，500 bp及250 bp处各切出一条单一的条带，这些条带大小与预期结果相符。进一步测序验证，用DNAMAN软件将测序结果与原始序列比对后，序列正确。结果表明HbHMGS1启动子和其5'缺失片段与GUS基因融合的植物表达载体构建成功。

2.2HbHMGS1启动子序列特征分析将克隆获得的HbHMGS1启动子序列，通过PlantCARE在线软件分析，预测结果(图2)表明，HbHMGS1启动子含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件以及多种调控元件，如4个光反应相关元件AT1-motif、Box 4、Box I、GAG-motif、1个乙烯响应元件ERE、1个赤霉素响应元件GARE-motif、2个茉莉酸响应元件CGTCA-motif、TGACG-motif、1个热胁迫相关元件HSE及1个干旱响应元件MBS等其他重要作用元件。

图2 橡胶树HbHMGS1启动子顺式作用元件分析

2.3烟草叶片瞬时表达分析笔者将构建好的6个与GUS基因融合的表达载体D1-1656，D2-1290，D3-1040，D4-699，D5-454及D6-213和阳性对照pCAMBIA1301通过农杆菌介导的方法分别转化到烟草叶片中进行瞬时表达。取包含每个缺失片段的烟草叶片进行GUS染色，结果显示，缺失片段D1-1656、D2-1290、D3-1040、D4-699及D5-454都能够启动GUS基因的表达，叶片染色显蓝色，但是D6-213缺失启动子却不能够启动GUS基因的表达，GUS染色没有呈现蓝色，这一结果可能是因为距ATG上游的213 bp(-213/-1)缺少了转录起始或翻译必须的顺式作用元件，导致下游GUS蛋白不能够正常表达，且35S启动子能够正常启动GUS蛋白表达，GUS染色显蓝色(图4)，说明HbHMGS1启动子具有启动活性。

2.4HbHMGS1启动子在转基因拟南芥植株中的功能分析

2.4.1 HbHMGS1启动子组织特异性分析按照上述方法将构建好的HbHMGS1启动子与GUS融合的植物表达载体通过浸花法转化拟南芥。将检测为阳性植株的T2代转基因拟南芥植株进行GUS染色，获得了9株T1代株系，随机挑选2个株系进行GUS组织化学染色，分别选取了种子春化后生长6，12和17 d的幼苗，45 d成熟植株的根、茎、叶、花絮、果荚，以及17 d的35S驱动GUS转基因植株和野生型拟南芥进行GUS染色，染色结果表明，HbHMGS1启动子能够在转基因拟南芥植株的幼苗及成熟苗的各个组织中启动GUS基因的表达，且染色后呈现明显的蓝色，35S启动子转基因植株的GUS染色也很明显，但是野生型拟南芥显示GUS基因没有表达(图5)。

2.4.2 HbHMGS1启动子光照处理GUS活性表达分析笔者将2组含有HbHMGS1启动子的转基因拟南芥植株同时进行光照及黑暗处理后进行取样提蛋白测其酶活。结果显示：在持续光照条件下，光照24，48，72 h后，GUS蛋白活性逐渐上升，且光照处理96 h后，GUS活性增大到处理72 h的3.2倍，但是在处理120 h后，GUS活性下降到原来水平，随后保持平稳(图6)。持续黑暗处理转基因拟南芥苗后，黑暗处理12 h～48 h后，叶片GUS活性检测持续上升，在继续处理72，96 h后叶片GUS活性显著增加，且分别是处理48 h时GUS活性的1.38倍和2.13倍，但是在黑暗处理120 h后GUS活性没有继续显著上升，与处理96 h后GUS活性相近(图6)。

2.4.3 HbHMGS1启动子及其缺失片段响应热击和干旱处理表达分析热击(37 ℃)胁迫时，如图7A所示，D4-699、D5-454和D6-213缺失片段GUS活性都有明显的增强，且分别是未处理之前的1.40倍，1.54倍及1.94倍 ，表明-699到起始密码子-1处的这一段序列中可能存在数个响应热击处理的元件，且-1656到-699这一区域在响应热击处理后可能抑制了GUS基因的表达(图7A)。干旱胁迫时，如图7B所示，HbHMGS1启动子及其各缺失片段GUS活性检测基本有下降，但D6-213缺失片段GUS活性增加了1.63倍(图7B)。以上数据表明：HbHMGS1启动子响应热击区域可能主要集中在距起始密码子-1到上游-699这一段序列中；干旱响应区域则则主要位于-213到起始密码子-1(ATG)处的213bp序列中。

3 讨 论

本研究以GUS基因作为报告基因，通过烟草瞬时表达及稳定转化拟南芥实验分析HbHMGS1 基因5′上游启动子序列的启动活性，PlantCARE在线软件预测发现HbHMGS1启动子包含多种调控元件，通过GUS组织化学染色实验发现，HbHMGS1启动子在转基因拟南芥的幼苗时期及成熟时期的各组织器官中都有启动活性，其他研究发现芥菜中HMGS基因也可以在植株所有器官中表达[21]。 以上这一结果可能是因为类异戊二烯是植物中分布广泛的代谢物，且参与多种重要的生理过程，而HMGS基因对于生产各种类异戊二烯化合物起到至关重要的作用[22,23]，因此，HbHMGS1启动子能够驱动GUS蛋白在转基因拟南芥植株的各个组织器官中表达。

PlantCARE在线软件预测发现HbHMGS1启动子有4个光响应相关元件AT1-motif、Box 4、Box I、GAG-motif，且分布在该启动子序列的多个部位。因此，本研究对包含HbHMGS1启动子的转基因拟南芥植株进行了光照和黑暗处理，在光照处理96 h左右，GUS活性瞬间增大后又降低到原来水平，同样在黑暗处理下，GUS活性逐渐上升且在96h左右明显增加，但与光照条件下不同的是，GUS活性并没有急剧下降而是持续增大该结果表明，HbHMGS1启动子可能同时受光照和黑暗影响。本研究对T2代转基因拟南芥植株热击处理后，发现缺失启动子D4-699、D5-454及D6-213和对照相比GUS活性上升，D1-1656、D2-1290及D3-1040 GUS活性则下降，结果表明，-699到-1和-1656到-699分别存在正调控和负调控的热击信号。启动子在线作用元件预测结果显示，-1656/-1290、-1290/-1040、-1040/-699及-213/-1几个区域均存在热击响应元件HSE(AAAAAATTTC)，但是定量GUS活性检测中发现，存在热击响应元件HSE的几个缺失启动子正负调控并不一致。预测结果还发现，HbHMGS1启动子中包含有干旱诱导的响应元件MBS，分别位于-1656到-1290和-454到-213这两个区域，但是，经干旱处理各缺失启动子后，GUS活性除D6-213缺失启动子外均表现下降，MBS干旱诱导响应元件可能在负调控方面起到重要作用，但仍需进一步的实验验证。