HPLC法测定西藏不同产地虎耳草中虎耳草素含量

李子璇,韩 豪,吴 婕,聂丽娟,白彩娟

(1.西藏大学 医学院,西藏 拉萨850000；2.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室,陕西 汉中723001)

虎耳草(Saxifraga stolonifera Curt.)为虎耳草科虎耳草属植物虎耳草的全草,全世界约有400多种、中国有203种,主要分布于河北、陕西、甘肃等地区,西藏地区有101种,具有清热、解毒、消炎[1]、抑菌、抗病毒[2]、体外抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗雌雄性激素、诱导成纤维细胞调亡[5]、护肝[6]等作用,主要用于治疗风疹、湿疹、中耳炎、丹毒、咳嗽吐血、痔疾等疾病。研究表明,虎耳草素具有抗炎镇痛功效[2],西藏地区虎耳草资源丰富,本研究以采自西藏不同地区虎耳草为试验材料,以虎耳草素活性单体为对照,采用HPLC法对虎耳草中虎耳草素进行定量分析,旨在建立简便可控的虎耳草素检测方法,为西藏虎耳草资源收集、保护及开发利用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010A HT型高效液相色谱仪(日本岛津公司),配AglentSB-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；KT-250DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；FA2004B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；XP6型电子天平(瑞士 MET-TLER TOLEDO公司)；YS-08型小型高速粉碎机(北京正德机械设备有限公司)。

1.2 试剂

甲醇(色谱纯,韩国德山药品工业)；磷酸(成都金山化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯,韩国德山药品工业)；蒸馏水。槲皮素对照品(批号：20161028,北京生物科学与技术有限公司),绿原酸对照品(批号：20162019,中国食品药品检定研究院),虎耳草素对照品(批号：20170102,北京生物科学与技术有限公司)。

1.3 材料

实验用虎耳草分别采自西藏不同地区,共收集7批样品,经西藏大学医学院鉴定为虎耳草属的全草。

2 实验方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱为AglentSB-C18(250mm×4.6mm,5μm)分析柱,虎耳草素以乙腈(A)∶0.1%磷酸溶液(B)为流动相,检测波长为275nm,流速1mL·min-1,柱温30℃,进样量10μL。

2.2 对照品溶液制备

精密称取对照品虎耳草素4.26 mg,置于25 m L棕色容量瓶中,加甲醇适量进行超声溶解,稀释至刻度,摇匀,用针孔滤膜(0.45μm)滤过,得对照品溶液,待测。

2.3 供试品溶液制备

取虎耳草样品自然晾干,粉碎,过60目筛,精密称取虎耳草粉末1.0 g,置50 m L容量瓶中,加70%甲醇至刻度,50℃水浴超声提取,超声功率为250W ,40k Hz,70%甲醇补足损失重量,摇匀,用针孔滤膜(0.45μm)滤过,得对照品溶液,待测。

2.4 线性关系考察

精密量取对照品溶液,按照以上色谱条件测定虎耳草素的含量,以进样量(μg)为横坐标X,色谱峰面积(A)为纵坐标Y进行线性回归。计算得回归方程为：Y虎耳草素=18.828X-18.295,R2=0.9995,线性范围为0.831～106.42μg·m L-1。样品和对照品色谱分别见图1、图2。

图1 虎耳草素样品色谱

图2 虎耳草素标准品色谱

2.5 精密度试验

取虎耳草样品(山南篦齿虎耳草)按“2.3”项制备供试样品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,重复进样6次,每次进样10μL,测得虎耳草素的峰面积,计算其RSD值为2.1%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取样品(同上)6份,按照“2.3”项分别制备6份样品液,按“2.1”项下色谱条件测定,每次进样10μL,测得虎耳草素峰面积,计算其RSD值为3.1%(n=6),符合中国药典关于重复性的要求,表明该方法重复性好。

2.7 稳定性试验

取样品(同上)6份,按照“2.3”项分别制备6份样品液,室温条件下,在0、2、4、6、8、12、分别进样10μL,按“2.1”项下色谱条件测定峰面积,并计算其RSD值为2.7%(n=6),结果表明样品中虎耳草素在24h内基本稳定。

2.8 回收率试验

精密称取已知含量虎耳草6份。分别加70%甲醇30 m L,虎耳草素对照品溶液1 m L,按“2.3”项方法制备、“2.1”项色谱条件测定,进样10 m L,计算各对照品的平均加标回收率和RSD值。结果见表1。

表1 虎耳草素回收率

2.9 样品含量测定

精密称取7批虎耳草样品2.0 g,按“2.3”项方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件测定虎耳草素的含量,计算其结果。见表2。

表3 虎耳草中虎耳草素的含量

3 讨论

本研究采用超声辅助提取,HPLC法测定西藏产虎耳草中虎耳草素的含量,测定结果线性关系良好,精密度、重复性、回收率均符合中国药典有关要求,样品稳定性好,表明此方法简便、快速、准确,可用于虎耳草素含量的测定。在对虎耳草素进行提取时,分别用不同浓度的甲醇进行提取,结果发现70%的甲醇提取效果最好。

对7批不同产地虎耳草中虎耳草素进行测定,含量范围在0.008～0.125 mg/g,其中含量最高的是在拉萨夺底沟采集的异叶虎耳草,含量最低的是南木林县采集的藏中虎耳草,我们从测定结果也可以看出,不同种间的虎耳草素含量存在很大差异；同一种虎耳草采集海拔不同,采集时间不同,虎耳草素含量差别很大,采集时间早、海拔低的虎耳草素含量较高。熊丹丹等[7]对虎耳草中虎耳草素进行了测定,发现不同省份(不含西藏)虎耳草中虎耳草素的含量差异很大,范围在1.42～5.98 mg/g,但是与西藏各地区的虎耳草相比含量较高,这可能与提取方法、采集时间、海拔高度等都有一定的关系。

多种藏药的原药材都含有虎耳草,比如,二十五味余甘子丸、二十五味松石丸、二十五味绿绒蒿丸等。目前,市场上虎耳草原药材来源不明,种类不明,势必会造成药效的不同,本研究对不同种、不同海拔、不同时间虎耳草属的7批样品进行了检测,并对结果进行了分析,为藏药原药材的优选提供了理论依据。