草甘膦对菱生长、光合色素和抗氧化酶系统的影响蔡欢

吴中华

【摘 要】草甘膦是目前世界范围内使用范围最广、用量最大的广谱、灭生性除草剂。因其被大量利用于农业生产中，不仅在土壤中存在残留，同时在水环境中检出率也很高，对水生生态系统带来一定威胁。本研究通过模拟实验，选取水生植物菱（Trapa bispinosa Roxb.）于不同浓度（0，0.05，，0.1，0.3 mmol/L）的水环境中培养14天后，测定其生长、光和色素含量以及抗氧化酶活性等指标，以观测水体中草甘膦对菱的生态毒理作用。

【关键词】草甘膦；水生植物；抗氧化酶系统；菱

草甘膦是目前世界上使用范围最广的农药，因其对杂草的毒害具有相对非选择性，对深根多年生草本植物，莎草和阔叶杂草的去除都非常有效，所以常被用于农田和非耕地的除杂用（Annett et al.，2014）。草甘膦主要是通过喷施在植物叶面之后被植物内吸后，积累于植物地上的分生组织，抑制5一烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶，可以防止氨基酸苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成，使植物不能合成它生存所必需的某些芳香氨基酸，导致植物次生代谢和蛋白合成反应失衡（Bai & Ogbourne，2016；Zhong et al.，2018a；张合彩等，2018），以及莽草酸合成途径受阻，具有受损的莽草酸代谢的植物易患各种植物病原体，植物最终死亡（范甜甜等，2017）。

草甘膦被大量使用后，其残留物通过雨水、排灌、地表径流以及直接排放（被用于水田杂草的去除）等方式进入水体，在水体中检出率很高，影响水生生态系统（Borggaard & Gimsing，2008）。草甘膦进入土壤大多被土壤吸附，但在水体环境中较难分解，对水生环境带来严重威胁。本研究通过模拟实验，对菱进行不同浓度的草甘膦水溶液培养后，测定其生长指标、光合色素含量及各抗氧化酶活性，以观测草甘膦对水生植物菱的生长、生理影响，为后续治理和修复工作提供参考。

1.材料和方法

（1）实验材料

菱，双子叶植物纲，桃金娘目，菱科、菱属的一年生水生浮水草本植物。本实验所用植物采自湖北省武汉市东湖水域。

（2）实验方法

①实验处理

将取得植株用自来水彻底清洗，去除黄叶爛叶后以10%霍格兰营养液进行7天驯化，之后取生长状况良好、大小相近的植物（并记录初始鲜重）按实验浓度设置（0，0.05，0.1，0.3mmol/L）进行培养，14天后收获，测定各项指标。

实验所使用的草甘膦均为纯度≥95%的原药粉剂。

②植物鲜重的测定

实验结束采集样品后，使用蒸馏水对其表面进行冲洗，去除附着物，擦干水分后用万分天平（精确度0.1mg）称量植株验后鲜重（FW）。

③叶绿素含量测定

光合色素测定参考Jampeetong 和 Brixl （2009）方法加以调整，取0.1g植物叶片剪碎，放入试管中，加入10mL95%乙醇，密封置于黑暗中24h，用紫外分光度计测定470，649 和 665nm的吸光值，根据Lichtenthaler 和 Wellburn （1983）的方法计算植物叶片中的叶绿素a、b以及类胡萝卜素含量（mg/g FW）。

④MDA及H2O2含量测定

MDA含量（mmol/g FW）用硫代巴比妥酸（TBA）法测定（王学奎&黄见良，2015）。

H2O2含量的测定，采用紫外分光光度法测定，参照Patterson等（1984）。可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250法测定（mg/g FW）（Bradford，1976），以牛血清蛋白（BSA）为标准蛋白。

⑤游离脯氨酸含量测定

游离脯氨酸含量的测定则是使用快速比色法（Bates等，1973）。

⑥抗氧化酶活性测定

取植物叶片0.1g加入50mMPBSpH7.8（内含1%PVP）在冰浴下研磨， 在冷冻离心机下10000g离心10min（施海涛，2016），收集上清液，即为粗酶液，置于4℃环境中保存，用于后续指测定。

过氧化氢酶（CAT）活性采用分光光度法，以1min内吸光值A240减少0.1的酶量为一个酶活单位（U），酶活性U/（g·min FW）表示（苍晶&赵会杰，2013）。过氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定，在560 nm处测定，以抑制NBT光化还原的50%定义为一个SOD酶活性单位。抗坏血酸过氧化物酶（APX）是以抗坏血酸作为电子供体，将H2O2还原为H2O。测定时以加入H2O2为起始点，1 min内反应液在290nm波长下变化0.01为一个APX酶活力单位。

2.实验结果

（1）相对生长率

菱在无草甘膦加入的对照组中，鲜重稍有增加。在低浓度（0.05mmol/L）草甘膦胁迫下，植物鲜重增加，相对生长率显著上升（p=0.001）。随着草甘膦浓度的上升，在中高浓度下植株鲜重均出现了负增长的现象，与对照组相比，高浓度草甘膦（0.3mmol/L）相对生长率显著下降（p<0.001）。

（2）光合色素含量

和对照组相比，低浓度草甘膦环境下菱的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均显著提高（p<0.01），与植物鲜重表现一致，尤其是高浓度草甘膦胁迫下植物光合色素含量与对照组相比表现出一定下降，其中叶绿素b受影响最明显，降至对照组含量的57%。

（3）MDA、H2O2、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量

MDA含量是衡量细胞膜脂过氧化水平的主要标志之一，草甘膦培养14天后，植物体内MDA含量显著上升。而植物体内H2O2含量不因草甘膦的加入而受到明显影响，其含量与对照组无显著差异。菱的可溶性蛋白含量变化如表1.中所示，随着草甘膦的加入有下降的趋势，但在低浓度环境下并未达到显著水平，在中高浓度草甘膦胁迫下，植物体内可溶性蛋白含量显著降低。与对照组相比，游离脯氨酸含量受草甘膦的影响而下降，其中在高浓度下，下降水平达极显著。

（4）抗氧化酶活性

如图1.a，菱体内CAT活性因草甘膦的加入而下降，且下降程度与草甘膦浓度正相关。与对照组相比，CAT活性下降在高浓度草甘膦环境下达到显著水平（p=0.005）。图3.b所示为植物SOD活性变化，草甘膦对SOD活性影响显著，其中在低浓度水平下表现最为明显，在中高浓度胁迫下，酶活性下降幅度有所减缓。中低浓度的草甘膦能够刺激菱体内APX活性提高，但随着草甘膦浓度的进一步上升，APX活性明显下降，显著低于对照组水平。

3. 讨论

在2016 年全球农化行业产品结构中，草甘膦在全球除草剂市场中占比约 48%，是我国最大的农药品种，也是全球用量最大的农药品种（杨斌，2017）。因其大量使用，所以引起了多方面对其毒性的研究。在低浓度的草甘膦处理下，菱的生长和色素含量均有一定的提高，可能是由于在植物收到一定胁迫下表现出来的应激性，以平衡外界环境带来的机体损伤。但在高浓度条件下，植物的叶绿素水平较对照组明显下降。许多研究表明，草甘膦可以显著降低植物叶绿素含量（Saunders，Pezeshki，2014），草甘膦对叶绿素含量的影响是影响叶绿素的合成和加速叶绿素降解。其中叶绿素b表现最为明显，仅降至对照组含量的57%。有研究表明，叶绿素b的含量降低会影响植物体内光系统的稳定性，从而导致光合作用的反应过程失衡，降低植物的对胁迫的耐受性。这表明，草甘膦对菱的胁迫途径之一可能是通过影响植物体内叶绿素b含量从而降低光合作用效率，导致植物死亡（Zhong et al.，2018b）。

MDA是膜脂过氧化的主要产物，是衡量细胞膜受损程度的生物指标。在本研究中，MDA含量在三种浓度的草甘膦胁迫下均显著提高，说明草甘膦对菱的毒害作用明显，仅低浓度就能对其膜脂带来明显伤害。H2O2含量可以衡量植物受胁迫的情况，但在本实验中，H2O2含量在各草甘膦水平下均无明显变化，这可能是由于抗氧化系统的各种酶被激活，及时清楚了由于植物应激产生的过量H2O2。

SOD、CAT和APX是植物抗氧化系统中的主要保护酶，SOD是该保护系统中的第一道防线，可催化超氧阴离子自由基（O2-）歧化形成H2O2和O2（Wu等，2010），CAT和APX的主要功能这是清除植物体内多余的H2O2。在本实验中，APX活性在中低草甘膦浓度条件下显著提高，承担了大量植物体内H2O2的清除工作，Gomes和Juneau（2016）观察到草甘膦处理可以使浮萍积累MDA和H2O2，APX酶活性提高以平衡此种损伤。而CAT和SOD活性在草甘膦胁迫环境下显著降低，这可能是由于植物体内H2O2含量在胁迫环境下并没有显著上升，不足以刺激机体酶活性提升，同时在胁迫作用下，菱的CAT和SOD在该种胁迫作用下易被破坏。

【参考文献】

1. Annett， R.， Habibi， H.R.， and Hontela， A. 2014. Impact of glyphosate and glyphosate-based herbicides on the freshwater environment. JOURNAL OF APPLIED TOXICOLOGY 34：458-479. 10.1002/jat.2997

2. Bai， S.H.， and Ogbourne， S.M. 2016. Glyphosate： environmental contamination， toxicity and potential risks to human health via food contamination. ENVIRONMENTAL SCIENCE AND POLLUTION RESEARCH 23：18988-19001. 10.1007/s11356-016-7425-3

3. Zhong， G.， Wu， Z.， Yin， J.， and Chai， L. 2018a. Responses of Hydrilla verticillata （L.f.） Royle and Vallisneria natans （Lour.） Hara to glyphosate exposure. CHEMOSPHERE 193：385-393. 10.1016/j.chemosphere.2017.10.173

4. Zhong， G.， Wu， Z.， Liu， N.， and Yin， J. 2018b. Phosphate alleviation of glyphosate-induced toxicity in Hydrocharis dubia （Bl.） Backer. AQUATIC TOXICOLOGY 201：91-98. 10.1016/j.aquatox.2018.05.025

5. 蒼晶， and 赵会杰. 2013. 植物生理学实验教程. 高等教育出版社： 北京

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7. 施海涛. 2016. 植物逆境生理学实验指导. 科学出版社： 北京

8. 王学奎， and 黄见良. 2015. 植物生理生化实验原理与技术. 高等教育出版社： 北京

9. 杨斌. 2017. 草甘膦市场及国际贸易分析. 农药市场信息：31-34

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