转移因子对猪丹毒杆菌SpaA抗原免疫效果的影响

胡辉灿，刘 洋，姚 清，赵 墩，余兴龙

(湖南农业大学 动物医学院，湖南 长沙 410128)

猪丹毒是由红斑丹毒丝菌(俗称丹毒杆菌)引起的一种急性、热性、烈性传染病，广泛分布于世界各地，是危害世界养猪业的重要传染病之一。随着规模化养猪业的发展及猪丹毒疫苗的广泛使用，猪丹毒得到了有效控制。但是近几年有关猪丹毒的病例报道逐渐增多，表明猪丹毒的危害又日益严重[1-3]。

目前，免疫接种猪丹毒的传统疫苗(灭活疫苗和弱毒疫苗)仍是预防猪丹毒最有效的方法，但这些疫苗均存在一定的缺陷，例如，灭活疫苗在灭活过程中可能导致抗原表位缺失或抗原性减弱，从而导致免疫效果不佳；弱毒疫苗因减毒不彻底会存在毒力返强的风险。随着规模化养猪业的不断发展，开发高效安全的猪丹毒疫苗成为目前最迫切的需求。20世纪90年代，人们开始从基因水平上研制猪丹毒重组亚单位疫苗。SpaA(Surface protective antigen A)蛋白是猪丹毒重组亚单位疫苗的研究热点，它是猪丹毒杆菌所有血清型共有的抗原，具有良好的免疫原性[4]。相较于传统的疫苗而言，重组亚单位疫苗的抗原分子质量较小，产生的抗体水平有限，因此，寻找一种能够有效增强机体免疫力的分子物质是目前基因工程疫苗的一个研究方向。

转移因子(Transfer factor，TF)是存在于人和动物免疫淋巴细胞内的小分子物质，其主要成分是小分子多肽和低聚核苷酸。TF带有致敏淋巴细胞的特异性免疫信息，在受者体内能够诱导T细胞转变为特异性致敏淋巴细胞，因此，它能够特异地将供者的细胞免疫功能被动地转移到受者体内，使受者获得特异性细胞免疫功能[5]。自20世纪50年代发现TF以来，国内外学者对其做过很多研究，发现其具有分子质量小、无毒、无抗原性、不引起过敏反应等一系列优点，将其广泛应用于人畜疾病的防治，取得了一定的成绩。在人医临床上，TF主要用于免疫缺陷、恶性肿瘤、抗病毒感染等领域的治疗。20世纪80年代后，我国将TF应用于兽医免疫和临床治疗，大量研究表明，TF与动物疫苗同时使用能够不同程度地增强机体产生特异性抗体的能力，且在治疗畜禽疾病方面也存在一定效果[6-9]。

本研究制备了猪丹毒SpaA特异性TF及普通TF，比较了两者之间的免疫活性，探讨其特异性对猪丹毒基因工程亚单位疫苗的免疫增强作用，为TF在兽医临床上的应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验小鼠及分组 供试ICR雌性小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物中心(购买编号：43004700037007)。

1.1.2 主要仪器及试剂 大肠杆菌BL21(DE3)-SpaA由湖南农业大学分子与免疫实验室构建并保存；IDA-4FF蛋白纯化介质购自武汉汇研生物科技有限公司；ISA201油佐剂购自法国赛比克公司；Amicon-Ultra-15超滤管(MWCO10KD)购自Merck Millipore公司；BCA蛋白定量测定试剂盒、MULTISKAN MK3酶标仪和低温离心机均购自Thermo公司。

1.2 试验方法

1.2.1 SpaA疫苗的制备

1.2.1.1 SpaA蛋白的诱导表达 取10 μL大肠杆菌BL21(DE3)-SpaA甘油菌接种至10 mL具有卡那抗性且终质量浓度为30 μg/mL的灭菌LB培养基中，置于摇床中37 ℃、180 r/min培养12 h后，将复苏菌种接种至200 mL灭菌LB培养基中，37 ℃、180 r/min增菌至OD600为0.8左右，加入终质量浓度为240 μg/mL的IPTG，37 ℃、180 r/min诱导6 h。诱导完毕，离心收集重组蛋白表达菌体，用10 mL超纯水充分重悬菌体，超声波破碎，取全菌和上清进行SDS-PAGE电泳鉴定。

1.2.1.2 SpaA蛋白的纯化及疫苗制备 将离心后的上清液以Ni2+亲和层析法进行蛋白质纯化，具体操作参考汇琼亲Ni-4FF(IDA)蛋白纯化操作手册，取纯化后SpaA蛋白的流穿液、洗涤液、洗脱液进行SDS-PAGE电泳鉴定。

取5 mL蛋白质纯化液加入至等体积的ISA201佐剂中，充分搅拌混匀后配制成SpaA抗原，4 ℃保存备用。

1.2.2 小鼠特异性TF的制备 将实验室配制的猪丹毒SpaA抗原免疫10只ICR雌性小鼠(体质量20～22 g)，每免疫1次间隔1 d，共免疫3次，每次免疫的疫苗剂量为100 μL，抗原含量为10 μg。第3次免疫21 d后，将小鼠剖杀，取脾脏并去除脂肪和被膜，用蒸馏水冲洗干净后，称质量。用剪刀将脾脏剪碎，等量加入生理盐水后，用高速匀浆机匀浆3次，每次1 min，反复冻融3次后，离心取上清，将上清液转移至截留分子质量为10 ku的超滤管中，5 000×g离心30 min，收集超滤液，然后经0.22 μm滤膜过滤除菌，-20 ℃保存备用。

1.2.3 小鼠普通TF的制备 另取10只未免疫小鼠脾脏，按照1.2.2中方法，制得普通TF，-20 ℃保存备用。

1.2.4 BCA法测定小鼠TF 利用BCA蛋白定量测定试剂盒对小鼠TF进行测定，具体操作步骤参考Thermo公司BCA蛋白定量测定试剂盒操作说明书。

1.2.5 小鼠TF的无菌检测 分别取10 μL小鼠特异性TF与普通TF接种到巧克力琼脂培养基上，将培养基倒扣于温箱内，37 ℃培养12～16 h，进行无菌检验。

1.2.6 小鼠TF的安全性检测 取100 μL小鼠特异性TF和普通TF分别腹腔接种2只小鼠，同时设置对照组接种等剂量的生理盐水，于接种后48 h内观察并记录小鼠的各项生理活动，48 h后剖杀小鼠，检查其腹腔及各脏器有无异常病理变化。

1.2.7 动物免疫试验 选取20只体质量为20～22 g的小鼠，将其随机分成4组(特异性TF组、普通TF组、仅免疫组、阴性对照组)，每组5只，使用1.2.4中方法对小鼠TF进行定量后，分别将特异性TF与普通TF腹腔接种至小鼠体内，剂量为150 μg/只。24 h后，对2组TF处理后的小鼠均免疫SpaA抗原，并以未接种TF的免疫小鼠(标记为仅免疫组)和空白组作为对照，免疫剂量100 μL/只，抗原含量10 μg/只。

1.2.8 间接ELISA法检测小鼠血清猪丹毒IgG抗体 在接种疫苗后12、21、30 d，分别对小鼠进行眼球采血，参照刘晓波[10]的方法对小鼠血清进行猪丹毒IgG抗体检测。首先将原核表达并纯化后的SpaA蛋白以100 ng/孔包被于96孔酶标板，于4 ℃包被24 h后，用PBST洗涤2次。然后每孔加入110 μL的封闭液，于37 ℃条件下封闭1 h后，再于37 ℃干燥2 h，用加干燥剂的封口袋进行封装，4 ℃保存。最后进行间接ELISA法检测，将所有试剂材料室温回温后，每孔加入100 μL用血清稀释液稀释的待检血清(1∶100稀释)，37 ℃孵育30 min；每孔加入250 μL的PBST，洗涤4次，轻拍干，每孔加入100 μL的辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠酶标二抗(1∶1 000稀释)，37 ℃孵育30 min；每孔加入250 μL的PBST，洗涤4次，轻拍干，每孔加入50 μL的四甲基联苯胺(TMB)底物显色，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入50 μL的终止液(0.6 mol/L H2SO4)，终止反应；待冷却至室温后，在450 nm波长下测量吸光度。

2 结果与分析

2.1 SpaA蛋白的表达及纯化

如图1所示，大肠杆菌BL21(DE3)-SpaA成功表达出分子质量为60 ku，能够可溶性表达的SpaA蛋白。用Ni2+亲和层析法对上清液进行纯化后，得到了纯化的SpaA蛋白。

1：SpaA全菌；2：SpaA上清；3：SpaA流穿液；

2.2 小鼠TF的质量浓度

小鼠TF为透明液体，呈淡黄色。利用ELISA Calc软件分析得BSA标准蛋白曲线如图2所示，标准品的直线回归方程为：Y=0.190 91+1.102 05X(r>0.99)。利用上述标准品的直线回归方程，经计算得出，小鼠特异性TF的质量浓度为2.56 mg/mL，小鼠普通TF的质量浓度为2.40 mg/mL。

图2 BSA标准蛋白曲线

2.3 小鼠TF的无菌检测和安全性试验结果

将小鼠特异性TF和普通TF接种于巧克力培养基上培养16 h后未见有细菌生长。将小鼠特异性TF、普通TF和等量的生理盐水分别接种至小鼠腹腔，然后对小鼠生理活动进行观察发现，2种TF处理组与生理盐水组的小鼠相比，无明显异常的生理现象。48 h后剖杀小鼠检查，各项器官无明显病变情况，说明制得的小鼠TF安全无毒。

2.4 小鼠血清猪丹毒IgG抗体检测结果

在接种SpaA疫苗后12、21、30 d，对小鼠进行眼球采血并进行猪丹毒IgG抗体检测，如图3所示，小鼠血清猪丹毒IgG抗体水平变化曲线中，小鼠特异性TF组和普通TF组的抗体IgG水平在免疫后21、30 d均高于仅免疫组，且差异显著(P<0.05)，2个TF处理组在免疫21 d后能够维持较高的抗体水平，且2种TF处理组内21 d和30 d的抗体水平经t检验无明显差异(P>0.05)，说明TF能诱导SpaA疫苗快速产生抗体，提高SpaA疫苗的免疫效果，但与TF的特异性关系不大。

图3 小鼠猪丹毒抗体水平变化曲线Fig.3 Curve of mouse erysipelas antibody levels

3 结论与讨论

早期研究证实，动物脾脏中含有大量的转移因子，本研究以小鼠脾脏为原始材料，制得猪丹毒特异性TF和普通TF，探究了TF对猪丹毒SpaA疫苗的免疫增强效果，并比较了两者之间的免疫增强活性，结果表明，2种TF与猪丹毒SpaA疫苗联合使用后可明显提高小鼠的抗体水平，且与TF的特异性关系不大。TF能够增强猪丹毒SpaA疫苗产生的抗体效价，提高机体抗猪丹毒杆菌感染的能力。特异性TF是指动物感染某种特定抗原后产生针对该抗原特定活性的核酸，在本研究中，猪丹毒SpaA特异性TF与普通TF在提高机体免疫效果上没有表现出明显差异，可能与接种特异性TF的剂量和频率过低以及机体的特异性免疫应答能力不足有关。

基因工程亚单位疫苗是20世纪80年代出现的一种新型疫苗，由于其具有成本低、安全性极高、无需灭活等优点成为疫苗研发的热点，但其主要的不足之处是免疫原性较低，需要合适的佐剂与之搭配才能产生较好的免疫效果，而TF恰好能充当这一重要角色，即TF作为免疫激活剂进入机体后，使造血系统在短期内产生大量白细胞的同时活化淋巴细胞，促进T淋巴细胞生长和分裂，从而能够显著提高机体的细胞免疫水平，缩短机体免疫应答期，促使机体快速产生抗体[11]。TF作为一种新型的免疫制剂，已被证实对活疫苗和油乳剂灭活苗具有免疫增强作用[12-14]，而在基因工程亚单位疫苗的免疫效果上研究甚少。本研究为我国研制高效的猪丹毒基因工程亚单位疫苗提供了一种新思路。

TF具有广泛的免疫学调节活性，且其作用不受动物种属的限制，即猪的TF能将其免疫活性转移给犬、鸡、鼠和人，在兽医临床上已有许多相关报道[15]。我国肉禽养殖业发达，而动物的脾脏在屠宰中一般被废弃，因此，将其利用开发动物TF产品具有广阔的市场前景，TF也将发挥其巨大的功效。