某屠宰场大肠杆菌O26的分离与鉴定

付文静 董 晨 禹金龙 胡 洁 江 芸

(1. 南京师范大学食品与制药工程学院，江苏 南京 210097；2. 江苏省疾病预防控制中心，江苏 南京 210097)

与人类疾病相关的产志贺毒素大肠杆菌(shiga toxinescherichiacoli, STEC)最主要的血清型是大肠杆菌O157:H7[1-2]。然而，近年来，关于非O157 STEC，尤其是“big six” STEC(O26、O45、O103、O111、O121、O145)暴发事件的报道逐渐增多，国外尤其是发达国家对“big six” STEC的关注度越来越高。由于其传染剂量低，且相关的疾病暴发病例数量多，自2012年美国农业部食品安全检验局(USDA-FSIS)宣布这6个主要血清型为生肉、绞碎牛肉和牛肉产品的必检病原体[3]。向美国出口牛肉的设施必须符合FSIS制定的标准，以防止产品掺入STEC细菌[1,4-6]。因此，了解非O157大肠杆菌的污染情况、采取有效防控措施是当下迫切需要解决的问题。

国外相关报道[6-8]表明O26是非O157大肠杆菌中最主要的血清型，已成为美国、亚洲、欧洲等STEC食源性感染的第二大常见原因。据美国疾病预防控制中心2010年报告[9]，在非O157 STEC感染事件中，患病率从高到低依次为22%O26、16%O111、12%O103、8%O121、7%O45和5%O145。O26 STEC可导致人类的广泛感染，从轻度腹泻到出血性结肠炎(HC)，在某些情况下导致溶血性尿毒症综合征(HUS)[10]。O26感染暴发可发生在牛肉、与牛接触的农产品和人对人传播[11-12]。反刍动物，尤其是牛，是O157和非O157 STEC的主要污染源[13]，通过粪便排泄到环境，进而可污染水、新鲜农产品、牛肉及其制品。牛的屠宰加工与分割是牛肉质量最初的保证环节，决定着储藏前分割牛肉的产品质量，也是后续加工的基础。然而牛肉在屠宰加工中会受到来自于空气、水、粪便、皮毛、内脏、淋巴结、工具、容器和屠宰操作者等各个方面带来的微生物的污染，污染的方式和程度主要取决于加工和处理方法的卫生控制措施及储藏和配给环境等。目前中国对非O157的研究尚较少[14]。本试验拟以非O157大肠杆菌中最主要的血清型O26为对象，选择某规范化牛屠宰场，对屠宰过程中牛胴体及环境样品进行大肠杆菌O26的分离与鉴定，以了解其污染状况，以期为非O157大肠杆菌的食品安全和风险评估提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

大肠杆菌O157:H7(编号CICC21530)：中国工业微生物菌种保藏管理中心；

大肠杆菌DH5α、1株大肠杆菌O26阳性菌DNA全基因组：江苏省疾病预防控制中心；

改良胰蛋白胨大豆肉汤(modified tryptic soy broth, mTSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(tryptone soya agar, TSA)、酵母浸粉(yeast extract)、亚碲酸钾、头孢克肟、P-10A新生霉素、P-10B新生霉素：北京路桥技术有限公司；

TaqTM(with Mg2+free buffer)、100 bp DNA Marker：大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司；

Qiagen multiplex PCR kit：德国Qiagen公司；

琼脂糖：北京天根生化科技有限公司；

细菌基因组DNA提取试剂盒、4S Red染料：上海生工生物科技有限公司；

Rainbow agar培养基：美国BIOLOG公司；

免疫磁珠试剂盒：美国Romer labs®公司；

O26抗原血清：日本生研公司；

所有引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要仪器设备

PCR仪：Mastercycler personal型，德国Eppendorf公司；

凝胶成像仪：GelDoc 2000 system型，美国BioRad公司；

高速离心机：TCL-16G型，上海安亭仪器厂；

琼脂糖凝胶电泳仪：DYY-2C型，上海天能科技有限公司；

生物安全柜：SG403A Sterile GDRD型，美国Baker公司；

生化培养箱：SHP-150型，上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 采样方法 选择安徽省某规范化牛屠宰场，对屠宰过程中牛胴体及环境样品进行大肠杆菌O26的分离与鉴定，不同部位采样均采用无菌棉签涂抹方法。

(1) 牛胴体表面采样：本次共屠宰15头牛，试验随机选择其中5头牛胴体进行表面采样。对胴体内外表面分散在8～10个不同部位采样，均匀揩抹3次，迅速剪断棉签头落入装有25 mL已灭菌生理盐水的采样管中，每个部位用3～5支棉签。

(2) 刀具采样：用灭菌棉签蘸灭菌生理盐水后在刀的两面从刀尖涂抹到刀把，分别用6只棉签涂抹到整个刀片，迅速剪断棉签头，使之落入装有25 mL生理盐水的采样管中。

(3) 工人手采样：工人五指并拢，用3支蘸湿灭菌生理盐水的棉签在左右手，往返涂擦，剪去棉签头，装入含25 mL灭菌生理盐水的采样管内。

(4) 污水及血水采样：用一次性无菌吸管吸取30 mL污水(血水)样品放入灭菌50 mL采样管中。

1.2.2 样品前增菌 采集的样品在24 h内进行增菌处理，参考美国农业部方法及Svoboda等[15-16]的方法，稍作调整，进行增菌培养：将采集的样品及生理盐水放入均质袋中，均质2～3 min，取10 mL均质液加入到含有40 mL mTSB的均质袋中，于37 ℃，220 r/min摇床中培养22 h。

1.2.3 免疫磁珠法分离大肠杆菌O26 增菌后取1 mL的样品于1.5 mL离心管中，同时加入50 μL免疫磁珠。短暂涡旋混合，在室温下摇动样品15 min后，将样品管放置在磁分离架上5 min，使得磁珠吸在管壁上，弃去悬浮液；加入已灭菌的0.05% Tween20 PBS溶液1 mL重悬，重复上述步骤3次；最后用1 mL洗涤缓冲液重建样品，涡旋混合。处理后的样品取100 μL涂布于改良Rainbow agar培养基(modified rainbow agar, mRBA，添加0.05 mg/L 头孢克肟，0.15 mg/L亚碲酸钾，5.0 mg/L新生霉素)，在37 ℃培养24～36 h，按照mRBA说明书及美国农业部指导说明，挑取特征颜色的菌落，在mRBA培养基上继续划线，经3次分离纯化，挑取单菌落划线于非选择性培养基TSA-YE上保存，以待进一步鉴定。

1.2.4 细菌基因组DNA提取 采用煮沸法提取细菌基因组DNA[17]。将可疑菌株挑一环于150 μL灭菌双蒸水中，涡旋，充分混匀。99 ℃水浴处理10 min，冰浴2 min，12 000×g离心2 min，吸取上清即为细菌基因组DNA，-20 ℃冻存备用。

1.2.5 PCR检测O26及血清凝集试验 O26血清型鉴定用引物参考Machado等[18](表1)。PCR反应体系为25 μL，包括1 μL模板，PCR Master Mix 12.5 μL，O26上、下游引物(浓度均为10 μmol/L)各0.8 μL，不足部分用水补齐。PCR反应条件：95 ℃预变性15 min；94 ℃变性30 s，61 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增后的PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。对PCR阳性的菌株，采用O血清凝集试验进行验证。

1.2.6 多重PCR毒力基因检测 大肠杆菌O26血清型阳性的菌株采用多重PCR进行stx1、stx2、eae、hly4种毒力基因携带情况检测。引物序列如表1所示。PCR反应体系为25 μL：10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，MgCl 5 μL，4对引物(10 μmol/L)mix 9.4 μL，Taq酶0.25 μL，DNA模板1 μL，不足部分用水补齐。PCR反应程序：94 ℃ 预变性7 min；94 ℃变性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃退火40 s，25个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.4% 琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 PCR引物序列及扩增长度

1.3 数据处理

采用Excel进行数据处理，进一步计算污染率。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌O26的检出率

共收集了该屠宰场120份样品，包括地面样品3份、血水样品4份、污水样品8份、工具样品17份、工人手样品7份、红内脏样品16份、白内脏样品16份、胃内容物样品2份、胴体样品45份、肉品残渣样品中2份(表2)。各样品经前增菌、免疫磁珠富集、选择性培养基mRBA分离纯化后，挑取可疑菌落采用煮沸法提取DNA，进行O26血清型的PCR检测(图1)，结果仅扩增到1株阳性菌株。进一步对该菌株进行O血清凝集试验，结果如图2所示，阳性对照菌与标准O26抗原血清发生了显著凝集，阴性对照菌未发生凝集，而待测菌株发生了显著凝集，表明该菌株确证为O26。结果显示，屠宰场120份样品中仅鉴定出1株O26，该菌株分离自胴体样品，其他样品均未检测到O26。进一步计算胴体中污染率为2.22%(1/45)，总污染率为0.83%(1/120)(表2)。

目前国际上关于非O157污染调查已有较多报道。Bosilevac等[21]调查发现5个牛肉加工厂O26 STEC的检出率为23.4%。Molini等[22]对纳米比亚屠宰场调查结果显示，O26 STEC的检出率为10.43%。Svoboda等[16]调查美国7个小型和超小型牛肉加工厂，在胴体样本中的大肠杆菌O26的检出率为4.9%。在伊朗，340份零售牛肉中O26 STEC的检出率为3.23%[23]。然而，Arthur等[24]调查了美国牛肉加工厂，发现从牛胴体没有分离到大肠杆菌O26。Thomas等[25]关于爱尔兰牛中非O157调查，亦未从胴体样品中检出大肠杆菌O26。近期，本课题组[26]还从49份零售牛肉中分离出2株大肠杆菌O26，阳性率为4.1%。上述报道结果并不完全一致，本试验阳性检出率亦较低，这可能与环境、饲养、管理、屠宰工艺等多种因素有关。

2.2 多重PCR检测毒力基因

大肠杆菌导致人类疾病与其携带的毒力基因密切相关，如stx、eae、hly等[27]，其致病机理往往是多种毒力因子共同作用的结果。其中最主要的毒力因子是志贺毒素Stx，包括Stx1和Stx2，研究[28]发现只产Stx2的菌株相对于只产Stx1和既产Stx2又产Stx1的菌株具有更强的致病性。由eae基因编码的紧密素，可引起肠粘膜的“粘附和消除”(attaching and effacing)损伤[29]。hly基因编码的肠溶血素能够在宿主靶细胞膜上形成孔道，进而杀死宿主靶细胞。由eae编码的紧密素和hly编码的肠溶血素已被用作致病性STEC的可能流行病学标志物[30-31]。

1. 100 bp ladder Marker 2. 阳性对照 3. 阳性分离株 4. 空白对照

图1 阳性分离株O26血清型的PCR鉴定结果

Figure 1 PCR amplification forE.coliO26 antigen of one positive isolate

1. 阴性对照 2. 阳性分离株 3. 阳性对照

采样点阳性样品/总样本污染率/%地面 0/30.00血水 0/40.00污水 0/80.00工具 0/170.00工人手 0/70.00红内脏 0/160.00白内脏 0/160.00胃内容物0/20.00胴体 1/452.22肉品残渣0/20.00总计 1/1200.83

本试验采用多重PCR方法对上述大肠杆菌O26阳性分离株检测其毒力基因(stx1、stx2、eae、hly)，其中以大肠杆菌O157:H7 CICC21530为阳性对照，以大肠杆菌DH5α为阴性对照，结果如图3所示。阳性菌株CICC21530成功扩增出了4条阳性条带，而该阳性分离株未扩增出阳性条带，即它不携带上述4种毒力基因。

1. 100 bp ladder Marker 2. 阳性对照 3. 阴性对照 4. 阳性分离株 5. 空白对照

图3 大肠杆菌O26阳性菌株4种毒力基因多重PCR电泳图

Figure 3 Multiplex PCR amplification of four virulence genes of the positiveE.coliO26 isolate

3 结论

本试验调查了某牛屠宰场大肠杆菌O26的污染情况，采集的120份样品仅从牛胴体样品中分离到1株大肠杆菌O26，阳性率为0.83%，其中胴体检出率为2.22%。毒力基因的多重PCR结果显示该株大肠杆菌O26不携带stx1、stx2、eae、hly基因。本试验表明该牛屠宰场大肠杆菌O26的污染水平较低。本次调查检出率低且未分离到有毒菌株，可能与调查样本小有较大关系，为了更全面反映中国O26等非O157大肠杆菌污染情况，应加强和加大对该类致病菌的调查研究，进而为中国今后相关标准的制订和非O157大肠杆菌的有效监控提供科学依据。