八倍体小偃麦和硬粒小麦杂交后代的染色体组成分析

李亚莉 董艳辉 侯丽媛 聂园军 任永康 王育川 吴新明

（1山西省农业科学院生物技术研究中心，太原030031；2山西省农业科学院农业资源与经济研究所，太原030006；3山西省农业科学院作物科学研究所，太原030031；4新疆生产建设兵团第六师农业科学研究所，五家渠831300）

小麦作为全球的主要粮食，是种植范围最广的作物之一，但小麦品种遗传基础狭窄、遗传差异小，严重制约了小麦产量和品质的进一步提高。小麦近缘属种中具有许多改良小麦所需的优良基因，通过远缘杂交或其他手段将这些优良基因导入普通小麦，着力挖掘和利用小麦野生近缘种属的重要基因，是拓宽中国小麦育成品种的遗传基础和进行小麦遗传改良的重要途径[1-3]。

十倍体长穗偃麦草（Thinopyrum ponticum）是小麦族近缘多年生物种，具有生长繁茂、多花多实，抗条锈病、叶锈病、黑穗病和白粉病，抗寒冷、耐干旱等优良性状[4-7]；中间偃麦草（Thinopyrum intermedium）具有许多可供小麦育种利用的优良农艺性状，如耐寒、耐旱、抗真菌病和病毒病等[8-10]；硬粒小麦（Triticum turgidum L． ssp． durum，AABB）是栽培的四倍体小麦，是加工通心粉的优质专用小麦，富含赖氨酸和类胡萝卜素，具有较高的营养品质和加工品质，在欧洲许多国家及美洲、北非和中东地区很受欢迎[11-13]。本研究通过八倍体小偃麦和四倍体硬粒小麦杂交，创制同时含有偃麦草和硬粒小麦优异基因片段的育种中间材料，为小麦育种实践和生产提供更丰富的遗传资源；同时结合FISH、GISH、Mc-GISH技术分析，筛选后代材料，为深入研究外源染色体在小麦背景中的传递机制提供细胞学遗传依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验材料为八倍体小偃麦和四倍体硬粒小麦的杂交后代。其中，八倍体小偃麦有山农20（十倍体长穗偃麦草和小麦的杂交后代）、中3和中4（中间偃麦草和小麦的杂交后代），试验材料由中国科学院遗传与发育生物学研究所韩方普研究员提供。

1.2 试验方法

1.2.1 中期染色体的制备 根尖细胞中期染色体的制备、探针标记方法以及原位杂交程序均按照 Han等[14]的方法进行。每份材料分别选取约20粒籽粒饱满的种子，将挑选好的种子置于垫有湿滤纸的培养皿中发芽，待根长长到2～3cm时，剪取生长旺盛的根尖放在37℃的果胶酶和纤维素酶混合溶液中消化50min，然后用70%的酒精洗2次，捣碎，离心，再用100%的乙酸溶解，滴片。

1.2.2 原位杂交技术 植物总DNA的提取采用CTAB法[15]，利用微量紫外分光光度计检测样品DNA浓度，并统一稀释至终浓度为100ng/μL。原位杂交程序按照Han等[14]的方法进行，在GISH分析中，提取中间偃麦草的基因组DNA，用fluorescein-12-dUTP标记，小麦的着丝粒逆转录转座子用Texas red-5-dCTP标记，用中国春基因组DNA作封阻；在 FISH 分析中，pAs1探针的信号标记，pSc119．2探针的信号标记；在Mc-GISH分析中，提取长穗（中间）偃麦草的基因组DNA，用fluorescein-12-dUTP标记，B基因组作封阻。细胞学镜检采用OLYMPUSBX60荧光显微镜观察，用Photo-metrics SenSys CCD成像。

2 结果与分析

2.1 山农20和四倍体硬粒小麦杂交后代材料的细胞学特征 远缘杂交可以将近缘种属中的优异基因导入普通小麦中，应用Mc-GISH的基因组原位杂交技术检测，统计分析小麦染色体A组、B组和D组的染色体数目及十倍体长穗偃麦草染色体的数目。由图1可知，在被检测的后代材料中，未发现A组和B组（28条染色体）的后代材料，染色体数量稳定在40～44之间的材料较多；所有材料中均含有D组染色体10～14条，十倍体长穗偃麦草染色体0～14条，D组大部分材料染色体优先稳定在12～14条，而十倍体长穗偃麦草染色体则0～14条不等，可见小麦D组染色体优先传递到后代籽粒中。

图1 小麦D组染色体和十倍体长穗偃麦草染色体在总染色体数中的变化规律

进一步分析发现，山农20和四倍体硬粒小麦杂交后代材料2572、2578号个体中没有发现十倍体长穗偃麦草染色体（图2A、B）；在后代材料2591号个体中发现了多条附加十倍体长穗偃麦草染色体（图2C），且箭头所指处有染色体断裂和易位的现象。

图2 杂交后代材料根尖中期细胞染色体的Mc-GISH分析

2.2 中3、中4和四倍体硬粒小麦杂交后代材料的细胞学特征 材料创制过程中，将中3、中4和四倍体硬粒小麦杂交创制育种中间材料，使其集合多个属的优异基因。由图3所示，在被检测的后代材料中，发现少数A组、B组（含28条染色体）的后代材料；大部分被检测的材料均含有D组染色体1～14条，中间偃麦草染色体1～14条，没有发现小麦D组染色体较中间偃麦草染色体优先传递的规律，即小麦D组染色体和中间偃麦草染色体随机进入后代籽粒中。

图3 小麦D组染色体和中间偃麦草染色体在总染色体数中的变化规律

进一步分析发现，中3、中4和四倍体硬粒小麦杂交后代材料2469号个体中只有小麦A、B组染色体，共28条（图4A）；在后代材料2478号个体中发现了12条附加中间偃麦草染色体（图4B），且箭头所指处有染色体易位的现象。

图4 杂交后代材料的根尖中期细胞染色体的GISH和Mc-GISH分析

2.3 2576-1代换系抗条锈病鉴定结果 从约190份后代材料中筛选出3份稳定的代换系，应用GISH技术对其中的2576-1代换系分析发现，个体染色体总数为42条，其中有2条十倍体长穗偃麦草染色体（图5A箭头所示）；应用FISH技术检测并对染色体进行核型分析发现，有2条十倍体长穗偃麦草染色体代换了小麦的1D染色体（图5C）；图5D、E是对新代换系2576-1抗条锈病检测结果，图5E中的箭头所示是用生理小种M169侵染后，2576-1代换系出现坏死而未发现菌斑，表明该代换系具有抗条锈病的特性。下一步还将继续开展其他的抗病性检测，明确该材料在育种中的应用价值。

3 结论与讨论

在小麦远缘杂交育种研究中，为了明确远缘杂交后代外源染色体的传递率，从而有效提高其选择率，从单条外源染色体到多条或整套外源染色体在小麦背景中的传递研究不断增多[16-18]。其中，在小麦的远缘杂交育种中，由于偃麦草属和硬粒小麦的染色体传递率较高，育种家经常应用不同种属之间的非等倍体杂交创制附加系、代换系等育种中间材料，将近缘种属的优异基因导入普通小麦中[19-21]。

图5 2576-1代换系的染色体核型分析和抗性检测

本研究中，应用原位杂交技术检测八倍体小偃麦和硬粒小麦杂交后代材料染色体的组成情况。山农20和四倍体硬粒小麦杂交后代籽粒较大，染色体数量稳定在40～44之间的材料较多，小麦D组染色体组优先传递；而中3、中4和四倍体硬粒小麦的杂交后代中，结实率不高，后代籽粒皱缩、偏小，小麦D组和中间偃麦草的染色体随机进入杂交后代中；在所有的后代材料中筛选出3份单株性状、籽粒性状好，染色体稳定在40～44之间的代换系，并对其中的2576-1代换系进行抗病性检测，初步鉴定为抗条锈病，下一步将进行其他抗性检测以明确该材料的育种价值。