IL-4和IL-10基因多态性与肾移植受者环孢素致肝损伤的相关性研究*

艾阳文,刘 飞,李维亮,陈晓华,熊 磊,余爱荣,辛华雯△

(1.南方医科大学药学院，广州 510515；2.中部战区总医院临床药理科，武汉 430070)

环孢素(cyclosporine，CsA)是肾移植术中常用的免疫抑制剂，由于具有治疗指数窄、个体间生物利用度差异较大的特点，不良反应时有发生，CsA在临床广泛应用的同时，其所致的不良反应，尤其是肝功能异常损伤也引起了关注[1]。近年来，随着药物蛋白组学研究和药物基因组学研究的深入，认为年龄、性别、药物相互作用等许多非遗传因素会造成药动学的差异，但20%～95%药物反应的个体差异却是由遗传因素引起[2]。白细胞介素(IL)-4和IL-10均为体内的多效抗炎细胞因子，参与调节机体的免疫反应和炎性反应[3]。IL-10可以通过抑制T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞等细胞介导的免疫应答，抑制促炎细胞因子mRNA的表达，从而抑制促炎因子的合成和释放，维持体内免疫反应与炎性反应平衡。已有研究报道IL-4和IL-10与多种肝脏疾病，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝炎等免疫性肝损伤及部分药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)相关，但IL-4和IL-10基因多态性是否与肾移植受者CsA所致肝损伤相关目前国内外尚未见报道。因此，本研究选取了IL-4基因的rs2070874、rs2243250，以及IL-10基因的rs1800871、rs1800872、rs1800896位点作为研究对象，旨在探究上述基因多态性与肾移植术后CsA所致肝毒性的相关性，为寻求肾移植术后肝损伤的易感基因及术后合理用药提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取在中部战区总医院进行同种异体肾移植术3年以上并服用CsA的患者。年龄、性别不限，无严重心脏疾病，随访资料齐全。入选患者均使用CsA+吗替麦考酚酯(MMF)+泼尼松的三联免疫治疗方案。本研究经中部战区总医院伦理委员会审核通过，所有受试对象均了解本研究的目的及实施方案且均签署知情同意书。排除标准：排除术后失访、术后第1周死亡、术后第1个月移植肾失功、使用他克莫司或使用西罗莫司的患者，排除有其他致肝功能异常的因素(如病毒或细菌感染、胆道疾患、其他药物所致肝功能异常等)、移植术后3年内肝功能资料不全的患者。共有188例患者入组，男126例、女62例。将患者分为CsA所致肝损伤组(16例)和肝功能正常的对照组(172例)。分组标准：对照组术前丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)正常，术后服用CsA等免疫抑制剂后，随访期间AST、ALT小于40 U/L，且TB<20 μmol/L、DB<5 μmol/L。CsA所致肝损伤组：(1)术前ALT、AST、TB、DB均正常，术后服用CsA后，ALT、AST峰值大于或等于3 ULN(临床正常上限)或TB、DB大于3 ULN；(2)减少CsA给药剂量或撤药后肝损伤减轻或恢复正常；(3)排除其他致肝功能异常的因素(如病毒或细菌感染、胆道疾患、其他药物所致肝功能异常等)。两组在性别组成、移植时年龄、体质量、体质量指数(BMI)，以及移植术后7 d、1个月、3个月、6个月、1年、2年、3年的CsA口服日剂量上比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1观察指标 统计所有受试对象的性别、移植时年龄、身高、体质量、BMI、肾源(尸肾或亲属移植)、原发肾疾病、移植时间、吸烟史、乙型肝炎和丙型肝炎感染史、结核病史、高血压病史、糖尿病史、有无急性排异等一般临床资料，以及移植术后7 d、1个月、3个月、6个月、1年、2年、3年的CsA口服日剂量及血药浓度、肝肾功能、空腹血糖(FPG)、血脂、血常规、血压等实验室检测结果。

1.2.2CsA血药浓度检测 采用荧光偏振免疫法在TDx(美国Abbott Laboratories公司)分析仪上检测全血中CsA水平。所有检测试剂、标准品和质控均购自美国雅培公司。CsA在150～800 μg/L范围内日内和日间变异小于4%，最低检测限25 μg /L。

1.2.3基因型检测 采集肾移植受者血样1 mL，采用Maxwell®RSC Whole Blood DNA Kit (美国Promega公司)提取血液中基因组DNA，并利用紫外分光光度计进行质量控制。IL-4、IL-10各单核苷酸多态性(SNP)位点信息，见表1。rs2070874，rs2243250，rs1800871，rs1800872，rs1800896位点引物设计见表2。

1.2.4PCR片段测序 采用多重 PCR技术结合高通量二代测序技术对IL-4、IL-10的各SNP位点进行测序。在单管内进行多重 PCR扩增，纯化后的PCR产物于Ion torrent PGM测序仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)上测序。

表1 IL-4、IL-10各SNP位点信息

1.2.5PCR片段测序 采用多重 PCR技术结合高通量二代测序技术对IL-4、IL-10的各SNP位点进行测序。在单管内进行多重 PCR扩增，纯化后的PCR产物于Ion torrent PGM测序仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)上测序。

表2 引物序列

F:正向引物;R:反向引物

2 结 果

2.1一般临床资料比较 188例肾移植者中CsA致肝损伤患者16例，肝损伤发生率为8.5%，其中男性患者发生率为9.5%(12/126)，女性患者发生率为6.4%(4/62)，差异无统计学意义(χ2=0.504，P=0.478)。

2.2IL-4和IL-10基因各SNP位点的等位基因分布 IL-4、IL-10各SNP位点的等位基因分布频率见表3。IL-4 rs2070874位点C等位基因在肾移植受者中突变率为22.3%(83/372)，肝损伤组为12.5%(4/32)，对照组为23.2%(79/340)。IL-4 rs2243250位点C等位基因在肾移植受者中突变率为18.5%(69/372)，肝损伤组为9.4%(3/32)，对照组为19.4%(66/340)。IL-10 rs1800871位点C等位基因在肾移植受者中突变率为28.0%(104/372)，肝损伤组为25.0%(8/32)，对照组为28.2%(96/340)。IL-10 rs1800872位点C等位基因在肾移植受者中突变率为27.1%(102/376)，肝损伤组为21.9%(7/32)，对照组为27.6%(95/344)。IL-10 rs1800896位点G等位基因在肾移植受者中突变率为6.6%(24/364)，肝损伤组为3.1%(1/32)，对照组为6.9%(23/332)。以上各SNP位点等位基因在肝损伤组与对照组间分布频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 IL-4和IL-10基因各SNP位点的等位基因分布[n(%)]

2.3IL-4和IL-10基因各SNP位点的基因型分布 IL-4、IL-10各SNP位点基因型频率在CsA致肝损伤组和对照组中符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。经χ2检验，IL-4 rs2070874、rs2243250位点及IL-10 rs1800871、rs1800872、rs1800896位点各基因型在两组间分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；IL-4和IL-10各SNP位点的显性、隐性、相加模型在两组间分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

2.4单倍型分析 运用SHEsis在线分析软件(http://analysis.bio-x.cn)对IL-4和IL-10的SNP位点进行连锁不平衡分析，结果发现，IL-4基因的rs2070874与rs2243250位点存在强连锁不平衡(D′=0.981，r=0.763)；IL-10基因的rs1800871、rs1800872、rs1800896位点间存在完全连锁不平衡(D′=1.000，r>0.184)。进一步对IL-4、IL-10的SNP位点进行单倍型分析，结果显示，IL-10的C-A-A单倍型在两组间的分布比较，差异有统计学意义(OR=10.68，P=0.013)，使CsA致肝损伤发生风险提高10.68倍，而IL-10其余单倍型及IL-4各单倍型与CsA所致肝损伤无明显相关性(P<0.05)。IL-4、IL-10的单倍型在CsA致肝损伤组和对照组间分布，见表5。

表4 IL-4和IL-10基因各SNP位点的基因型分布[n(%)]

Dom：显性模型;Rec：隐性模型；Add：相加模型；-：无数据

表5 两组IL-4、IL-10的单倍型分布比较[n(%)]

2.5IL-4、IL-10基因多态性对CsA血药浓度的影响 IL-4、IL-10各位点基因多态性对CsA血药浓度的影响见表6。结果显示：术后1个月，IL-4 rs2070874、rs2243250位点相加模型和隐性模型的CsA血药浓度比较，差异有统计学意义(PAdd=0.002 3，PRec=0.003 2；PAdd=0.020 7，PRec=0.037 6)；术后3个月，IL-10 rs1800872位点显性模型的CsA血药浓度有显著性差异(PDom=0.047 9)；而在移植术后其余时间点，IL-4、IL-10基因多态性对CsA血药浓度无明显影响(P>0.05)。

表6 IL-4、IL-10基因多态性对CsA血药浓度的影响

续表6 IL-4、IL-10基因多态性对CsA血药浓度的影响

PAdd：相应基因型在相加模型中两组血药浓度比较；PDom：相应基因型在显性模型中两组血药浓度比较；Prec：相应基因型在隐性模型中两组血药浓度比较；NA：未分析

3 讨 论

DILI包括药物及其代谢产物引起直接的细胞应激(内源性途径)及触发免疫反应介导的肝损伤(外源性途径)[4]。其中促炎因子与抗炎因子之间的平衡决定了肝损伤的易感性及严重程度。

IL-4、IL-10是介导免疫性肝损伤的重要细胞因子，在慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等的发生、发展中起关键作用。IL-4和IL-10与DILI相关。王兰等[5]对3种肝损伤患者IL-10的表达水平研究发现，IL-10的表达在慢性乙型肝炎组、自身免疫性肝炎组、药物性肝炎组均有降低，提示IL-10在以上肝损伤模型中可能存在相似的作用机制，即抑制免疫细胞对肝细胞的破坏作用。动物实验研究表明，IL-10具有抗炎和抑制免疫反应的功能，从而发挥肝脏保护作用。赵亚朴等[6]研究发现，IL-10+CD8+T对Con A诱导的小鼠急性肝损伤有保护作用。程剑等[7]构建携带人IL-10基因的腺病毒载体Ad5-hIL-10，发现采用Ad5-hIL-10进行预防性干预可以有效预防四氯化碳(CCl4)诱导的肝细胞损伤，提高肝细胞在损伤诱导剂存在情况下的存活率。IL-10预防肝损伤主要是通过抑制T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞等细胞介导的免疫应答，抑制炎性因子mRNA的表达，从而下调炎性因子的合成和释放[8]。因此，IL-10可以减轻肝脏炎性反应，并降低各种肝损伤物质对肝细胞的毒性。IL-4在DILI中具有双重作用，抑制对CYP2E1自身抗原的调节应答发挥抗炎作用，同时诱导对药物半抗原的促炎反应[9]。动物模型中发现，IL-4介导双氯西林[10]、麻醉剂氟烷[11]、甲巯咪唑(MTZ)[12]诱导的小鼠肝损伤，并且在麻醉剂DILI中具有双重作用[13]。JARUGA等[14]研究表明，IL-4/STAT6通过增强肝细胞和窦内皮细胞中嗜酸细胞活化趋化因子的表达，并诱导IL-5表达，在Con A诱导的肝炎中起关键作用，从而促进嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞向肝脏转移并导致肝炎。

IL-10基因位于第1号染色体，包括5个外显子和4个内含子。对IL-10多态性的研究主要集中在启动子区的IL-10-1082(G/A)、IL-10-819(C/T)、IL-10-592(C/A)，其他大部分主要位于非编码区的内含子，IL-4基因位于第5号染色体上。LIANG等[15]研究表明，IL-10-592 A/C AA基因型和IL-10-819 T/C TT基因型的遗传多态性会增加乳腺癌患者多西他赛诱导的肝损伤的发生率。WANG等[16]研究表明，IL-4和IL-10基因多态性与抗结核药物所致的肝毒性有明显相关性。IL-4、IL-10的多态性可能导致其mRNA表达水平不同，从而产生不同的调节效应。

本课题组的系列研究是筛选CsA致肝损伤的易感基因，课题组前期已完成了针对339 例服用CsA的肾移植受者CYP3A4、CYP3A5、ABCB1、ABCC2、HLA-B多态性与CsA药物肝损伤的关联性的研究，从药物代谢、转运及免疫调控等方面探究CsA致肝损伤的发病机制。前期研究表明，ABCC2 rs717620的AA基因型是肾移植术后CsA肝功能异常发生的保护性因素；ABCC2 rs717620的GG基因型、CYP3A5*3、CYP3A4*18B的*1/*1基因型、ABCC2的GG/GG和ABCC2的GG/GA单倍体基因型是肾移植术后发生CsA肝功能异常的危险基因因素；而HLA-B* 1502 、ABCB1 1236C>T、ABCB1 2677G>T/A和ABCB1 3435C>T多态性与CsA所致的肝损伤无明显相关性[17-19]。细胞因子在DILI的产生中发挥重要的调控作用，且移植术后缺血再灌注损伤、免疫激活、内环境紊乱等可触发机体炎性反应，产生大量细胞因子。目前CsA致肝损伤是否与细胞因子相关国内外均未见报道，CsA致肝损伤的机制是否与IL-4、IL-10相关尚不明确。因此，本课题在前期研究的基础上，继续探讨IL-4、IL-10与CsA致肝损伤的相关性，以期从多方面阐明CsA致肝损伤的发病机制。

本研究探讨IL-4、IL-10基因多态性与肾移植受者CsA所致肝损伤的相关性。研究结果显示，IL-4的rs2070874、rs2243250位点和IL-10的rs1800871、rs1800872、rs1800896位点等位基因及基因型分布在CsA所致的肝损伤组与对照组间无明显差异，IL-10的C-A-A单倍型是CsA致肝损伤组的危险因素(P=0.013)，可使CsA致肝损伤的发生风险提高10.68倍，而IL-10其余单倍型及IL-4各单倍型与CsA所致肝损伤无明显相关性(P>0.05)。IL-4 rs2070874和rs2243250位点相加模型及隐性模型的CsA血药浓度在术后1个月有明显差异(PAdd=0.002 3，PRec=0.003 2；PAdd=0.020 7，PRec=0.037 6)；在术后3个月，IL-10 rs1800872位点显性模型的CsA血药浓度有显著性差异(Pdom=0.047 9)；而在移植术后其余时间点，IL-4、IL-10基因多态性对CsA血药浓度无明显影响(P>0.05)。

综上所述，本研究探究IL-4基因的rs2070874、rs2243250位点及IL-10基因的rs1800871、rs1800872、rs1800896位点的基因多态性与肾移植术后CsA所致肝毒性的相关性，为寻求肾移植术后肝损伤的易感基因因素及术后合理用药提供参考依据。