原发性胆汁性肝硬化患者外周血长链非编码RNA差异表达分析*

向国艳，樊 佳，叶震璇，付 雪，李红梅，张 华，4△

(1.贵州医科大学临检教研室，贵阳 550004；2.西南医科大学附属医院中医医院检验科，四川泸州 646000；3.贵州医科大学医学检验学院,贵阳 550004；4.贵州省人民医院检验科，贵阳 550002)

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一种渐进性发展的慢性自身免疫性肝脏疾病，以肝脏汇管区淋巴细胞浸润、胆管上皮细胞特异性损伤及血清中出现高滴度抗线粒体抗体为特征[1]。好发于中年女性，起病隐匿且病程长。其病因尚不完全清楚，可能与遗传易感性及环境等因素有关。熊去氧胆酸(ursodeoxy-cholic acid，UDCA)是目前唯一被美国肝病学会(AASLD)、食品药品监督管理局(FDA)批准的用于治疗PBC的有效药物[2]，但仍有患者治疗效果欠佳，最终需要肝脏移植。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指一类核苷酸超过200个碱基、不编码蛋白质的功能性非编码RNA分子[3]。研究表明，lncRNA可通过表观遗传修饰与转录调控、转录后加工、翻译调控等多种机制，在细胞生命活动中发挥重要作用。其功能失调时与肿瘤、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿等[4-6]疾病的发生、发展都有着密切的关系。近年来关于lncRNA的研究发展迅猛，但也只是冰山一角，绝大部分lncRNA的功能仍然未知。lncRNA关于PBC的研究则更是鲜有报道，现有的研究也是采用基因芯片的方法[7]。而基因芯片的假阳性率很高，也不能发现新的转录本。因此，本研究采用Illumina高通量测序技术，检测并分析PBC患者和健康对照外周血单个核细胞中lncRNA的表达差异，为PBC的研究提供新的方向。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年8-12月就诊于贵州省人民医院的PBC患者30例(PBC组)，男2例、女28例，平均年龄(50.20±10.94)岁。另选取同期于贵州省人民医院健康体检中心受检的30例健康者(对照组)，男2例、女28例，平均年龄(54.00±11.64)岁。两组间年龄与性别分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会审查通过(2017109)，且所有患者均知情同意。纳入标准：参照2009年AASLD推荐的诊断标准[2]。排除标准：系统性疾病引起的肝脏病变、自身免疫性疾病、药物和胆道梗阻等引起的肝脏病变等。

1.2材料与试剂 反转录试剂盒及SYBR GreenⅡ试剂盒购自大连TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；QUBIT RNA ASSAY KIT购自美国Invitrogen公司；Ribo-ZeroTMMagnetic Kit(Epicentre)购自美国NEB公司；RNA 6000 Pico chip购自美国Agilent公司；lncRNA测序、图像采集、数据分析等由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。

1.3方法

1.3.1PBMC的收集 采集PBC患者与对照组外周静脉血3～5 mL，3 500 r/min离心10 min，收集血浆于-80 ℃冻存备用。通过Ficoll分离法分离PBMC，并加1 mL Trizol冻存在-80 ℃备用。

1.3.2总RNA的提取、RNA文库建立及测序 Trizol法提取总RNA，QUBIT RNA ASSAY KIT对起始的总RNA进行准确定量，Ribo-ZeroTMMagnetic Kit(Epicentre)对总RNA中rRNA 进行分离去除，RNA 6000 Pico chip对去除 rRNA的总RNA进行质控，构建好去除rRNA的质控转录组测序文库后上机进行RNA-seq。

1.3.3测序结果的处理和分析 采用NGSQC软件对原始数据进行过滤和统计。Cuffquan和Cuffnorm软件进行表达水平分析，geometric方法对基因的表达进行标准化。差异RNA的筛选标准：|log2FC|≥1且P<0.05，即PBC组比对照组表达变化在2倍以上且P<0.05。对筛选出的差异RNA做层次聚类分析。基因本体(GO)功能分析与信号转导通路富集分析(KEGG分析)对差异表达mRNA的功能属性及生物学途径进行富集分析，显著富集是指P<0.05。根据差异表达基因、GO分析及KEGG分析的结果进行蛋白互作分析。经靶基因Cis-分析和Trans-分析预测可能与PBC相关的lncRNA。

1.3.4实时荧光定量PCR验证差异RNA的表达水平 选取PBC患者与健康对照各30例，经RNA/DNA/蛋白共提取试剂盒严格按照试剂说明书提取PBMC中的RNA，并用nondrop检测RNA的浓度和纯度。根据GeneBank设计引物，序列见表1。采用SYBR Green染料，通过2-ΔΔCt法分析目的基因的表达水平。每个样品做3个复孔，扩增条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。

表1 lncRNA NONHSAT250451.1、EGR1和GAPDH引物

EGR1：早期生长反应因子1；GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶

A、B：分别为差异表达mRNA与lncRNA的火山图；C、D：分别为差异表达mRNA与lncRNA的聚类分析图；红色：上调；绿色：下调，黑色：无差异

图2 差异表达RNA的火山图与聚类分析图

2 结 果

2.1总RNA质检结果 用于转录组测序的10个RNA样品，RNA总量大于或等于5 μg，260 nm与280 nm处吸光度比值(A260/280)在1.8～2.1范围内。甲醛变性胶和Agilent 2100电泳检测结果显示，电泳条带清晰，rRNA比值(28 s/18 s)≥1.5∶1.0；RIN≥7。受检的所有RNA样品基本符合Illumina RNA-Seq样品建库的实验要求，对照组以D2和D3为例，实验组以T1和T2为例，见图1。

2.2差异表达RNA聚类分析 根据筛选标准(|log2 FC|≥1且P<0.05)，差异的mRNA共5 143个(2 318个上调和2 825个下调)，差异的lncRNA共716个(367个上调和349个下调)。差异表达RNA的火山图与聚类分析图，见图2。

2.3GO功能分析 差异基因在GO功能分析：其中Biological Process富集到3 213个term、Cell Component富集到230个term，以及Molecular Function富集到354个term。共富集到的3 797个term中多数与炎症、免疫活性及代谢等功能有关。差异基因和背景基因在GO功能分析的每个二级条目上的分布情况，见图3。

2.4KEGG分析 共显著富集到33个term，在organismal system中富集到与免疫系统相关信号通路有TCR信号通路、趋化因子信号通路等。在Environmental Information Processing中富集到了与免疫相关的信号通路有核因子-κB (NF-κB)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、Jak-STAT 信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等，见图4。

图3 GO二级频率图

图4 差异基因KEGG通路分类示意图

A:差异表达的蛋白互作网络总图；B：EGRI及其相关调控基因互作网络图

图5 蛋白互作网络图

2.5蛋白互作分析与靶基因预测 蛋白互作分析发现早期生长反应因子1(EGR1)是差异mRNA中唯一的转录因子，且与白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-2等炎性因子及MAPK13、叉头蛋白3(FOXO3)等相互作用，见图5。另外，靶基因Cis-分析预测到lncRNA NONHSAT250451.1对EGR1具有靶向调控作用。

2.6lncRNA NONHSAT250451.1与EGR1表达情况 PBC组患者PBMC中lncRNA NONHSAT250451.1与EGR1表达分别为对照组的7.26、3.91倍，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图6。

A:lncRNA NONHSAT250451.1；B:EGR1

图6 lncRNA和EGR1的相对表达情况

3 讨 论

PBC是一种以免疫介导的肝内小胆管渐进性破坏、慢性胆汁淤积为特征的肝脏疾病[1]。2015年被更名为原发性胆汁性胆管炎，这更准确地反映了绝大多数患者的疾病自然史[8]。目前PBC的发病机制尚不完全清楚，较为公认的假说是在遗传及环境等因素相互作用下，机体免疫耐受屏障破坏而引发PBC。可见PBC具体发病机制有待于继续探索。

lncRNA是指一类核苷酸超过200个碱基、不编码蛋白质的功能性非编码RNA分子。研究发现异常表达的lncRNA参与了多种疾病的发生，如PCA3是一个前列腺癌特异表达的lncRNA，在前列腺癌患者尿液中异常升高，已经用于临床前列腺癌诊断[4]。lncRNA GAS5、linc0597和lnc-DC等在SLE患者血浆中高表达，有望成为SLE新的诊断标志物[5]。可见，疾病中差异表达的lncRNA有可能成为疾病的诊断标志物和潜在的药物治疗靶点。本研究通过高通量测序技术，筛选PBC患者外周血PBMC中差异表达的lncRNA，寻找可能与PBC发病相关且特异的lncRNA。

研究显示，共富集到差异表达的lncRNA 716个，差异表达的mRNA 5 143个。GO功能分析与KEGG分析发现，显著差异表达的mRNA与炎症、免疫活性、代谢等功能及多种免疫信号通路相关(如TCR、NF-κB和Jak-STAT等信号通路)。免疫细胞及免疫相关信号通路(如TCR信号通路)的异常激活都可能是参与PBC发病的原因之一[9]。其中，差异表达基因EGR1与免疫细胞增殖、分化有关，其激活与否受TCR信号通路的影响[10]。因此笔者猜想EGR1可能与PBC发病相关。而且蛋白互作分析发现，EGR1与IL-1β、IL-2、IL-6和FOXO3等相互作用。FOXO3可以与FOXP3结合导致机体调节性T淋巴细胞(Treg)数量异常[11]，进而打破体内免疫平衡促进自身免疫性疾病的发生。IL-1β、IL-2、IL-6等炎性因子也都与PBC的发病相关[12-13]。另外，有研究发现EGR1可以直接与辅助性T 淋巴细胞1(Th1)细胞特异性的转录因子T-bet的启动子区结合，促进T-bet转录，进而促进Th1细胞增殖及干扰素-γ(IFN-γ)的大量释放[10]。而KAWATA等[14]发现IFN-γ的缺失极大地抑制了胆管炎的发展，说明Th1介导的免疫炎性反应在致PBC肝脏病变过程中具有重要作用。Th1/Th2比例失衡是PBC主要发病机制之一[15]。可见，EGR1可能是通过影响Th1/Th2比例，以及与多种炎性因子的相互作用来参与PBC的发生。

靶基因预测结果发现，lncRNA NONHSAT250451.1在EGR1基因上游4 297 bp左右的位置处以Cis调控(Antisense)的方式对EGR1进行调控。而且，通过NONCODE数据库确定NONHSAT250451.1确实为lncRNA。因此笔者推测，lncRNA NONHSAT250451.1可能是通过调控EGR1的表达来参与PBC的发生，其在PBC中发挥的作用有待于进一步的探讨。实时荧光定量PCR发现，lncRNA NONHSAT250451.1与EGR1在PBC患者PBMC中的表达水平较对照组分别高出7.26、3.91倍，与测序结果一致。该结果进一步证实lncRNA NONHSAT250451.1与EGR1在PBC患者中存在明显的差异，有望成为PBC的诊断标志物和药物治疗靶点候选者之一。另外，本研究还发现了许多显著差异表达的lncRNA，如XLOC_000016上调了21.27倍，XLOC_117137上调了19.22倍，XLOC_072647下调了22.23倍，XLOC_039465下调了14.32倍。这些lncRNA在PBC中均未见报道，但是它们在PBC组中的表达差异非常显著，可能对PBC的发生、发展有着重要的调控作用，在后续的研究中值得进一步的挖掘。

综上所述，本研究发现了很多差异表达的lncRNA，并经文献找到可能与PBC发病相关的mRNA，猜想与之相关的lncRNA可能也与PBC的发生相关。本实验发现了EGR1及对其有靶向调控作用的lncRNA NONHSAT250451.1。在后续的实验中将进一步探讨lncRNA NONHSAT250451.1在PBC发病机制中的作用，期望为以后PBC的诊断和治疗提供新思路。