miR-216a在胃癌组织和患者血浆中的表达变化及临床意义*

张 同，李 庆，舒 若，徐 玉，施承民，曾玉剑，孙 亮，田 衍，肖博凯，王昆华，罗华友

(昆明医科大学第一附属医院胃肠与疝外科/云南省消化病研究所/云南省消化道疾病防治工程技术研究中心，昆明 650032)

胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，具有较高的致死率，并且在我国发病率较高。近年来，手术治疗、放射治疗和化学治疗等取得了一定成效[1-2]，但是淋巴转移和预后不良等问题依然严重[3]。miRNA通过与靶基因相互作用，在肿瘤发生过程中起着重要的调控作用[4-6]。许多miRNA已经在胃癌相关方面研究中应用，如miR-21[6]、miR-141[3]和miR-30b[7]等。miR-216a最初报道与急性胰腺炎相关[8]，而后报道参与了胰腺癌[9-11]、肝癌[12]、肺癌[13]、卵巢癌[14]和肾癌[15]等的发生。miR-216a在胃癌方面的研究多在细胞水平进行[16-18]，临床研究报道较少，且关于其在胃癌组织中的表达变化存在分歧[18-19]。因此，本研究比较分析miR-216a在胃癌组织和患者血浆中的表达水平，以及手术前后的表达变化，旨在为胃癌的临床诊断和治疗预后提供一些参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2012年1月至2014年12月在本院接受手术治疗的胃癌患者120例作为观察组，同时选取120例健康志愿者作为对照组。纳入标准：病理学诊断为腺癌；患者术前未行放射治疗、化学治疗、靶向治疗等抗肿瘤治疗；患者或其家属自愿签署知情同意书。排除标准：病理学诊断为非腺癌；术后3年的随访资料不完整。观察组男79，女41，平均年龄(61.52±8.96)岁。对照组男66例，女54例，平均年龄(55.24±7.46)岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1样品收集 采集胃癌患者的肿瘤组织(非坏死部分)和对应的癌旁组织(距肿瘤组织5～10 cm)约0.2 g，手术切除标本立即放入液氮中，随后置入-80 ℃冰箱冷冻保存备用。采集胃癌患者手术前、手术后第7天血液，以及健康志愿者血液各3 mL。血液样品在乙二胺四乙酸(EDTA)采血管中室温静置约30 min后，4 ℃下3 500 r/min离心5 min，收集血清，然后4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，去除细胞成分，收集上层血浆，置于-80 ℃保存备用。

1.2.2RNA提取 按照GenEluteTMPlasma/Serum RNA Purification Mini Kit试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)方法抽提、保存患者胃癌组织标本和血浆标本中的总RNA，利用荧光分光光度计(美国Thermo Fisher公司)测定血浆RNA水平。提取的RNA置于-80 ℃保存备用。参照Taq-Man miRNA Reverse Transcription试剂盒(美国Applied BioSystems公司)说明合成cDNA，miR-216a和U6的特异性引物见表1。

1.2.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 利用SYBR Master mix试剂盒(日本Toyobo公司)在ABI 7500 RT-PCR仪(美国Applied BioSystems公司)上对上述合成的cDNA进行检测。每个反应重复3次。miR-216a和U6的RT-qPCR引物序列见表1。以U6小环RNA作为内参[17，20]，结果采用2-△△Ct相对定量法[21]计算。

表1 RT-qPCR所用引物序列

F：正向；R:反向

1.2.4其他方法及术后随访 本试验选取的胃癌患者均采用腹腔镜或开腹胃癌根治术[1-2]进行治疗。胃癌组织幽门螺杆菌(Hp)采用硼酸亚甲蓝染色方法[22]检测。术后3年内平均每3个月随访1次，记录肿瘤复发和患者死亡等情况。

2 结 果

2.1miR-216a在胃癌组织中的表达降低 RT-qPCR检测结果表明，miR-216a在胃癌患者非坏死胃癌组织中的相对表达水平低于对应的癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

*：P<0.01

图1 miR-216a在癌旁组织和胃癌组织中的表达水平比较

2.2手术前后miR-216a在胃癌患者血浆中的表达变化 手术前，观察组胃癌患者血浆miR-216a表达水平高于对照组健康人群，差异有统计学意义(P<0.01)。手术后，胃癌患者血浆miR-216a表达水平低于手术前，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

表2 胃癌患者临床病理特征与miR-216a相对表达水平的相关性

2.3miR-216a的表达水平与胃癌患者临床病理特征的相关性 胃癌组织中miR-216a相对表达水平与患者性别、年龄、Laurén分型、Hp感染、淋巴结转移和肿瘤大小均无关(P>0.05)。胃癌患者术前血浆miR-216a相对表达水平与性别、年龄、Laurén分型和Hp感染均无关(P>0.05)。胃癌组织miR-216a相对表达水平与肿瘤分化程度和TNM分期相关(P<0.05)。术前血浆miR-216a相对表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移和肿瘤大小均相关(P<0.05)，见表2。

*：P<0.01；#：P<0.05

图2 手术前后miR-216a在胃癌患者血浆中的表达水平

2.4miR-216a表达水平与胃癌患者治疗预后的相关性 按照miR-216a的相对表达水平将胃癌患者划分为高值组和低值组，相对表达水平大于或等于平均相对表达水平的患者归为高值组，相对表达水平小于平均相对表达水平的患者归为低值组。分组及胃癌患者术后3年内的复发率和生存率见表3。胃癌组织miR-216a高值组的术后复发率和生存率较优，差异无统计学意义(P>0.05)。患者血浆miR-216a低值组的复发率和生存率优于高值组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 miR-216a表达水平与胃癌手术治疗预后的关系

-：无数据

3 讨 论

胃癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，在发展中国家致死率尤其高。有研究报道，早期诊治的胃癌患者其生存率可以有效提高[2，4]。此外，由于预后不良，即使是经根治性切除手术，或者联合放射治疗、化学治疗等方式，胃癌患者的生存率也不高[1，5]。因此，探寻新的生物靶点或标记物在胃癌早期诊断、治疗预后等方面有重要意义[4，6]。

本研究同时收集了胃癌患者的肿瘤组织、癌旁组织和手术前后患者血浆，利用RT-qPCR技术对miR-216a的表达水平进行了检测。研究结果显示，miR-216a在患者胃癌组织中的相对表达水平明显低于癌旁组织(P<0.01)，这与miR-216a在胰腺癌和卵巢癌等其他癌症患者肿瘤组织中的表达结果一致[9，14，18]。此外，miR-216a在胃癌患者手术前血浆中的相对表达水平明显高于对照组健康人群(P<0.01)，这也与其在胰腺炎等患者血浆中观测的表达结果一致[23]。相关性分析结果显示，胃癌组织和患者血浆中miR-216a的相对表达水平均与肿瘤分化程度和TNM分期有关(P<0.05)。但是，未+低分化和Ⅲ+Ⅳ分期患者组织中miR-216a表达分别低于中+高分化和Ⅰ+Ⅱ分期患者，而血浆中miR-216a表达与此相反。这可能与miR-216a作为抑癌因子抑制胃癌细胞的增殖和侵袭有关[16，18]，而由于组织和血浆中miR-216对癌变响应的时效性不同[8]，使得它们在相同分化程度和分期患者中的表达差异明显。这与其他抑癌因子如miR-141-3p等的表达模式类似[3]。这些结果表明，miR-216a在患者胃癌组织和血浆中的表达变化差异均较为明显，且与胃癌临床病理特征存在相关性。因此，miR-216a可能在胃癌的早期诊断中有一定的临床价值。

进一步分析表明，接受手术治疗后，胃癌患者血浆miR-216a相对表达水平明显低于手术前(P<0.05)。目前，对miR-216a在胃癌或其他癌症患者手术前后血浆中的表达变化研究较少，难以对此趋势作比较验证。但是，该结果说明miR-216a可以作为胃癌手术疗效评价的相关指标。并且，miR-216a在胃癌患者血浆中的相对表达水平与患者术后复发率和生存率存在相关性。本研究结果显示，手术前血浆miR-216a低表达患者的术后复发率和生存率均优于高表达患者(P<0.05)。此外，由于无创、稳定性好、检测结果可靠等特点[4]，临床检测胃癌患者血浆miR-216a表达水平对胃癌早期诊断和治疗预后具有潜在的重要意义。