马铃薯种质资源的晚疫病抗性鉴定

王洪洋，刘 晶，董金美，张婷婷，郑楠楠，严 懿，李灿辉

(1.云南师范大学生命科学学院，云南 昆明 650500；2.云南师范大学马铃薯科学研究院，云南 昆明 650500)

马铃薯Solanum tuberosum起源于南美洲安第斯山山脉一带，属于茄科茄属植物。马铃薯种质资源丰富，主要分布在秘鲁和玻利维亚一带，有1个普通栽培种、7个近缘栽培种和228个野生种。我国是世界上马铃薯种植面积最大的国家，马铃薯已成为我国仅次于水稻、小麦和玉米的第四大主粮[1]。然而，由致病疫霉菌Phytophthora infestans引起的马铃薯晚疫病严重威胁着全球马铃薯生产安全，严重时导致马铃薯大幅度减产[2]。晚疫病造成全球马铃薯每年减产至少15%，损失达100多亿美元[3]。目前，晚疫病的防治主要依赖化学农药，然而大量使用药剂不仅污染环境，还会加速病菌产生抗药性和加快突变进程。因此，迫切需要一种稳定而持久的方法来对抗晚疫病的侵害，选育具有广谱抗性的马铃薯种质资源成为防治晚疫病的必然趋势。

早在20世纪50年代国外就开始对马铃薯晚疫病抗性鉴定进行深入研究，而我国直到21世纪初才开展鉴定研究工作[4]，近几年来陆续鉴定了一批抗病的马铃薯种质材料[5—8]。马铃薯野生种资源中含有丰富的抗病资源[9—10]，如 S. demissum[11—14]、S. bulbocastanum[15—17]、S. venturii[18]等。然而，由于 P. infestans群体极易变异并能克服大部分马铃薯抗性基因，超级生理小种极有可能出现，进而导致现有抗病品种抗性丧失[19—20]。因此，急需扩大对马铃薯抗病资源的筛选、鉴定，特别是对研究较少的安第斯山栽培亚种马铃薯资源的筛选、鉴定。本研究利用离体叶片接种法对国内外收集和引进的43份马铃薯种质资源进行晚疫病抗性鉴定，以期获得对晚疫病具有广谱抗性的马铃薯种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

43份马铃薯资源包括28份野生种、8份原始栽培种S. phurejia和7份安第斯山栽培亚种，由中国农业科学院深圳农业基因组研究所和云南师范大学马铃薯科学研究院提供。感病对照为马铃薯品种‘Désirée’[21]，由云南师范大学马铃薯科学研究院提供。抗病对照为马铃薯品种‘加湘1号’[8]，由中国农业科学院深圳农业基因组研究所提供。所有材料无菌试管苗在含有4%蔗糖的MS培养基中繁殖，待试管苗生长30 d后移栽于温室塑料钵(20 cm×20 cm)中，浇水、施肥等按日常管理。将生长2个月健康无机械损伤的叶片用于接种。

晚疫病菌菌株HB09-14-2(生理小种：1.2.3.4.5.6.7. 9.10.11，A1A2交配型)由华中农业大学马铃薯实验室馈赠，接种于黑麦培养基上并在18 ℃培养。

1.2 晚疫病菌孢子悬浮液制备

取18 ℃平板培养20 d的新鲜晚疫病菌，用少量无菌水洗脱晚疫病菌孢子囊，并用血球计数板测定孢子囊浓度约1×105个· mL-1，将调整好浓度的孢子囊放置于4 ℃条件下促使游动孢子释放，备用。

1.3 离体叶片接种

采用离体叶片接种法进行晚疫病抗性鉴定[22]。待马铃薯苗生长2个月后，从健康植株上选取长势一致的叶片，用蒸馏水冲洗干净。先将湿润滤纸片放入接种盘中，然后将马铃薯叶背面朝上置于滤纸上，取10 µL配制好的游动孢子悬浮液分别接种于叶片主脉左右两侧，每份马铃薯材料接种10片叶，3次重复。将接种盘置于18～20 ℃培养室中黑暗保湿24 h， 此后将光周期调整为16 h/8 h(光照/黑暗)。

1.4 离体叶片接种调查

接种5 d后进行调查，先观察感病对照叶片症状和抗病对照叶片接种部位是否有过敏反应，然后对不同马铃薯种质资源叶片进行病斑面积和叶片总面积测量，计算出病斑占整个叶片总面积的百分比。评级标准参照娄树宝等[5]的标准(表1)。

表1 马铃薯晚疫病的抗性评价标准Table 1 Resistant evaluation criteria of potato to late blight

2 结果与分析

43份马铃薯种质资源对晚疫病菌HB09-14-2的抗性鉴定结果如图1和表2所示。通过离体叶片接种，发现3份S. phurejia材料(No. 1、No. 2、No. 3)和2份S. tuberosum ssp. andigena材料(No. 4、No. 5)对HB09-14-2表现为高抗，其接种部位同抗病对照‘加湘1号’一样出现过敏反应(图1)。另外，还鉴定出1份抗病材料(No. 6)，14份中抗材料(No. 7～No. 20)，21份感病材料(No. 21～No. 41)，2份高感晚疫病材料(No. 42、No. 43)。

图1 晚疫病菌接种部分马铃薯种质资源的表现Fig. 1 Symptoms of potato leaves inoculated Phytophthora infestans

表2 供试马铃薯种质资源晚疫病抗性鉴定Table 2 Resistant evaluation of potato germplasm to Phytophthora infestans

3 讨论

随着中国马铃薯主粮化战略的推进，马铃薯品种的优劣将在马铃薯生产中起着关键作用。虽然目前投入使用的抗病品种已有不少，但马铃薯晚疫病疫情仍不时爆发。P. infestans生理小种不断变异，使得普通的抗病材料难以具备持久的抗病能力，已选育的马铃薯品种正逐渐丧失作用[23—25]。因此，晚疫病种质资源的抗性鉴定和持久抗病材料的发掘将成为选育高品质抗晚疫病马铃薯品种的重要课题。

本研究采用离体叶片接种法，对28份野生种、8份原始栽培种S. phurejia和7份安第斯山栽培亚种马铃薯种质资源进行晚疫病的抗性鉴定，筛选出5份对强致病性晚疫病菌菌株HB09-14-2表现为高抗的材料(3份S. phurejia材料和2份S. tuberosum ssp. andigena材料)。虽然本试验未能对这5份材料进行田间自然病圃鉴定，但是相关研究表明，离体叶片法鉴定结果基本可反映马铃薯材料在田间的抗性水平[4]。本研究发现的5份对晚疫病表现高抗性的马铃薯种质资源，包括3份原始栽培种和2份安第斯山栽培亚种。该发现证实了栽培种和安第斯山亚种马铃薯中存在高抗晚疫病种质资源[26]。针对这5份高抗晚疫病资源，后续将采用混合接种P. infestans生理小种进行进一步的抗病鉴定及田间抗性评价，以期筛选出广谱、持久的抗晚疫病资源。此外，新筛选出的抗病资源的抗病基因鉴定、作用机制及其蛋白功能等均值得深入研究。