常规苏木精-伊红HE染色与环保试剂HE染色的效果对比

郑建华 金玉兰 邹泽阳

目前的临床病理组织苏木精-伊红染色(hematoxylin eosin，HE)染色处理时，通常采用含有二甲苯、含汞苏木素的传统试剂染色套液，但该试剂具有强烈的刺激性气味和毒害性，人体表皮在接触以后，会出现皮肤病，长期接触会引发癌症、呼吸道感染、智力严重衰退、肠胃溃疡、腹泻、呕吐、神志错乱、呼吸道衰竭、肺水肿等病害，导致人体产生易怒、焦虑、四肢抖动及思想难以集中等不良情绪[1-2]。传统试剂的废液直接排放后，一旦流入城市的地下水道系统，将会破坏城市水源，若要处理后再排放则需要很高成本，医院通常无法负担[3]。此外，传统试剂极易挥发，实际操作有难度。因此，寻找一种操作方便、无毒无公害、染色效果稳定可靠及经济适用的新型HE染色试剂当务之急。为此，本研究采用新型的环保试剂替代传统试剂，并对环保试剂的染色性能进行分析，比较新型的环保试剂与传统试剂HE染色处理后的效果。

1 材料与方法

1.1 基本材料

随机选取从2017年6月至2017年12月期间，到北京妇产医院病理科进行活检及相关手术后遗留的100例已经进行过传统试剂HE染色处理的病理组织片子纳入观察组，另选取2018年以来以相同的病理组织使用环保试剂进行HE染色处理的100例片子纳入对照组。观察组采用新型的环保试剂HE染色，对照组采用传统试剂HE染色。两组病理组织均包括大网膜、子宫、乳房、输卵管、卵巢、阑尾、子宫肌瘤、子宫内膜、淋巴结、平滑肌等组织，两组基本材料无差异，具有可比性。

1.2 相关试剂

环保型HE染色试剂由北京九州柏林生物科技有限公司研发；传统试剂包括的二甲苯、无水乙醇、含汞苏木素、分化液、返蓝液及伊红等原料均为北京益利精细化学品有限公司出品。

1.3 HE染色方法

(1) 对照组。采用传统HE染色试剂。

(2)环保HE染色试剂。采用环保型HE染色：①将观察组病理组织标本进行切片，用无苯切片脱蜡液Ⅰ、Ⅱ均处理5 min，用无苯切片脱蜡液Ⅲ再处理10 min；②用无水乙醇Ⅰ处理1 min后再用无水乙醇Ⅱ处理1 min，分别用95%、85%乙醇各处理10 s；③用自来水进行缓流清洗1 min后用苏木素稳定剂(高清恒染液)处理30 s，用苏木素染色液处理9 min左右后用自来水进行缓流清洗1 min；用0.5%的分化液处理2 s后用自来水进行缓流清洗1 min；④用返蓝染色液处理5 s后用自来水进行缓流清洗1 min；⑤用伊红染色液处理2 min后用自来水进行缓流清洗5 s；⑥用85%乙醇处理5 s后再用95%乙醇处理10 s；⑦用无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各处理10 s；⑧用无苯切片透明液I处理20 s后用无苯切片透明液Ⅱ处理1 min，用无苯切片透明液Ⅲ处理2 min；⑨湿封。

1.4 仪器设备

采用DM2000 LED型光学显微镜(德国Leica公司)观测；采用UC320C(MRNN)型高清数字显微镜相机[艾克腾视科技(北京)有限公司]进行CCD图像采集。

1.5 评价指标

(1)染色质量进行等级划分。①I级切片，可做出准确病理诊断，病理组织HE染色切片呈现色彩鲜艳、对比度分明、色彩渗透力强、呈现图像快、图像组织结构清晰等特点；②Ⅱ级切片，不妨碍做出准确的病理诊断，病理组织HE染色切片内呈现色彩较为鲜艳、对比较为分明、色彩渗透力比较强、呈现图像较快、图像组织结构比较清晰等特点；③Ⅲ级切片，完全不能用于病理诊断，病理组织HE染色切片内呈现色彩不鲜艳、对比不分明、色彩渗透力比较弱、呈现图像缓慢、图像组织结构模糊等特点。

(2)分析指标。对比两组病理组织的染色色彩、对比度、色彩渗透力、呈现图像的速度及图像结构清晰程度；比较相同病理组织在不同染色试剂下的HE染色效果。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，计数资料以%表示，采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组HE染色效果色彩比较

观察组各种病理组织的HE染色效果色彩较为鲜艳，但两组在Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级切片中的色彩比较差异均无统计学意义(x2=0.604，x2=0.533，x2=0.785；P＞0.05)，见表1。

表1 两组HE染色效果色彩的对比 [例(%)]

2.2 两组HE染色效果对比度比较

观察组各种病理组织的HE染色效果对比度较为分明，观察组Ⅰ级切片共有87例，而对照组则有88例，但两组对比度比较差异无统计学意义(x2=0.324，x2=0.001，x2=0.546；P>0.05)，见表2。

表2 两组HE染色效果对比度的对比[例(%)]

2.3 两组HE染色效果色彩渗透力对比

观察组和对照组各种病理组织的HE染色效果中，色彩渗透力强的Ⅰ级切片分别为86%和89%，两组比较差异无统计学意义(x2=0.529，x2=0.001，x2=0.631；P＞0.05)，见表3。

表3 两组HE染色效果色彩渗透力的对比[例(%)]

2.4 两组图像呈现速度比较

两组病理组织HE染色效果图像呈现的速度，观察组Ⅰ级切片有84例(占84%)，对照组Ⅰ级切片有85例(占85%)，两组比较差异无统计学意义(x2=0.312，x2=0.268，x2=0.721；P＞0.05)，见表4。

2.5 两组图像结构清晰程度对比

两组各种病理组织的HE染色效果的图像结构均具有较高的清晰水平，其中观察组Ⅰ级切片有87例(占87%)，对照组Ⅰ级切片有89例(占89%)，两组对比差异无统计学意义(x2=0.692，x2=279，x2=0.301；P＞0.05)，见表5。

表4 两组HE染色效果呈现图像速度的对比[例(%)]

表5 两组图像结构清晰程度的对比[例(%)]

2.6 两种试剂HE染色图像对比

环保试剂进行对病理组织的HE染色处理时，其色彩、对比度、渗透力、图像呈现速度、图像组织结构清晰度等5个指标出现I级质量切片的概率和传统试剂接近，环保试剂进行HE染色图像效果与传统试剂HE染色的效果基本一致。两组平滑肌、子宫内膜的HE染色效果对比如图1、图2所示。

图1平滑肌HE染色效果对比图(×40)

图2 子宫内膜HE染色效果对比图(×40)

3 讨论

HE染色法也被称之为苏木精-伊红染色法，是石蜡切片技术里最为常用的染色法。苏木精呈碱性，其主要功能为使细胞核内的染色质与胞质内的核酸质呈紫蓝色，而伊红呈酸性，主要功能使细胞质和细胞外基质中的成分呈红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学等诸多内容的教学科研中最基本的技术方法，也是临床上进行病理组织活检使用最为广泛的手段[4-5]。

在对病理组织进行的染色过程中，脱蜡过程的效果好坏对染色的质量有着比较关键的作用。环保型HE染色试剂的无苯切片脱蜡液I、II与传统试剂的二甲苯相比较，其脱蜡效果基本类似，但具有染色时间短、基本无异味、对人体的危害和环境的破坏小等优势[6-8]。环保型HE染色试剂中苏木精染液的最大特点是不含汞元素，能够做到在切片组织上迅速着色，分化后流水冲洗返蓝迅速，这要比传统的含汞苏木精染液的时间短，效果更好，最为重要的是，使病理技术工作人员彻底摆脱二甲苯和含汞苏木精染液所带来的毒害，避免接触对人体破坏极大的剧毒物质—黄色氧化汞[9]。同时，由于汞元素的彻底清除也极大地提高了染色液质量的稳定程度，从而在根源上避免人为因素和环境因素对含汞苏木精质量的影响，这更有利于提高对病理组织进行HE染色处理的质量。由于环保型HE染色试剂中不含二甲苯和汞元素，因此在更换新的试剂时不需要做过多处理。

随着社会的发展和经济水平的提高，人们更注重健康的生活质量，而对于危及身体健康的各种病害应引起高度重视。医院作为病毒传染最集中的领域，更应对环保及健康问题给予高度关注。目前，在医院以病理科为主的各科室已经成为病毒输出和污染环境的主要源头。在对病理组织进行HE染色试验时，以二甲苯、含汞苏木精为主的传统试剂因价格便宜，从而广泛用于临床和医学试验上，但其缺点显而易见，尤其是二甲苯、汞等有毒元素的危害较大。因此，寻找在HE染色时能够替代的环保试剂，已经成为当前病理技术工作者、病理实验室工作人员等最为迫切的需求。

传统试剂以二甲苯为主，这种有毒试剂不但毒害较大，一旦处理不当还会影响诊断结果，直接排放后污染较大，经过处理则需要耗费大量的成本[10-11]。二甲苯的危害很强烈，极易挥发，对人体危害极大。会严重刺激人体中枢神经和其他神经，长时间接触会引发人头晕目眩、四肢无力不听使唤、人体免疫功能严重衰退等，并有致癌风险。二甲苯对环境具有破坏性，一旦大量且未经过任何处理的废弃二甲苯流入城市的地下水道系统，将会彻底破坏城市水源。含汞苏木精中的汞元素也有极强的挥发性，会对人体中枢神经造成伤害，导致肠胃溃疡、腹泻、呕吐、神志错乱、呼吸道衰竭、肺水肿及死亡等严重病症，还会导致人产生易怒、激动、善忘、害羞、沮丧、结巴、胆小、焦虑、四肢抖动、思想难以集中等不良情绪[12]。汞元素不经过任何处理就排放后，会使汞迅速转化为剧毒物质甲基汞，使蔬菜、水果及鱼类携带汞元素，最后极大地危害人类[13-15]。因此，替换HE染色试剂中的二甲苯、汞等有害物质，研发替代性的环保试剂，已经是一种不可逆的趋势。朱建雯[16]报道，市场上曾出现过打着环保试剂“噱头”的产品，通常价格过高，或效果不佳，因此均未产生极大的应用效应，导致国内医院不得不依然使用传统试剂进行HE染色。

新型环保试剂推出后，受到了国内许多医院病理工作者的密切关注。本研究发现，环保试剂完全将二甲苯、汞等有害物质分离出去，且不易挥发、易进行生物降解、不会造成环境污染、无毒无公害。其主要特点有：①在染色的各个环节均表现良好，不会出现病理组织标本收缩等问题；②色彩艳丽、对比分明、色彩渗透力强、呈现图像快、图像组织结构清晰，与传统的HE染色试剂的染色效果基本一致；③废液易处理回收，无毒无污染；④使病理科活检成本降低，减轻了病患和医院的负担；⑤有效地防止了医院病理科工作人员及高校病理实验室人员遭受到有毒物质的袭扰。

环保试剂与传统试剂相比，具有染色效果科学及良好、无毒无公害、高效省力、低碳排放保护环境、降低活检成本以及减轻病患和医院的负担等优点。

环保试剂在临床的病理组织活检和相关病理研究中，有着较高的创新价值和实用价值，不仅其染色效果可靠、稳定，而且无毒无公害，完全可以代替以二甲苯、含汞苏木精为主要成分的传统试剂，是一种值得推广的试剂。