mTOR通路相关分子表达变化在HL60细胞增殖抑制中的作用研究

李琳 孙王男 任孝敏 姜红

【摘 要】目的：探讨维瑞肽多西紫杉醇对白血病HL60细胞增殖的抑制作用和分子机制。方法：CCK8法检测维瑞肽多西紫杉醇对HL60细胞增殖的影响。采用流式细胞仪分析细胞周期变化。CR实验检测TOR通路相关分子的mRNA水平的变化。结果：维瑞肽多西紫杉醇可抑制HL60细胞增殖，细胞周期阻滞于G0/G1期。TOR相关分子PI3K、AKT、mTOR分子mRNA水平明显下降。结论：维瑞肽多西紫杉醇抑制HL60细胞的增殖的作用与PI3K、AKT、mTOR分子mRNA水平表达下降有关。

【关键词】 HL60细胞;维瑞肽多西紫杉醇; 增殖

Methods： HL60 cells were subcultured in RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum， and the cells in logarithmic growth phase were cultured. The effect of VRT-DTX on the proliferation of HL60 cells was detected by CCK8 assay， and the inhibition rate of cell proliferation was calculated. Flow cytometry was used to analyze the changes of cell cycle after different drugs. qPCR method was used to detect the expression of PI3K、AKT and mTOR.RESULTS： voramide peptide docetaxel inhibited the proliferation of HL60 cells， and the inhibitory effect was enhanced with the increase of drug concentration and duration of action. The expression of G0/G1 phase is prolonged， S phase is shortened， cell cycle is arrested in G0/G1 phase; It indicated that voramide peptide docetaxel can exert anti-proliferative effect by induce cell cycle arrest of HL60 cells; the expression of PI3K、AKT and mTOR is significantly down-regulated. Conclusion： The voramide peptide docetaxel can inhibit the proliferation of HL60 cells， which correlated to down-regulation of PI3K、AKT and mTOR in HL60 cells.

Key words： HL60 cell; VRT-DTX; proliferation

【中图分类号】 R94

【文献标识码】 A【文章编号】 1672-3783（2019）04-03-031-01

白血病靶向治疗和定向诱导分化是目前国内外关注的重点方向之一。其中，与生长素受体特异性结合的维瑞肽与化疗药物结合可以增加化疗药物的靶向性。我们在研发多西紫杉醇-维瑞肽偶合物（简称维瑞肽多西紫杉醇）的基础上，重点探讨了其诱导白血病HL60细胞凋亡的作用，同时研究了其作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要原料与试剂耗材：

（DTX）2-维瑞肽偶合物（本课题组自行合成）;CK8试剂盒，碧云天公司;Annexin V /PI凋亡试剂盒，日本同仁公司;双抗，索莱宝公司。

1.2 细胞增殖与凋亡检测：CCK-8法测定细胞增殖，Annexin V-FITC/ PI双标的流式细胞仪法测定细胞凋亡水平。

1.3 qPCR检测在偶合物作用下HL60细胞中BAX， Caspase3/8/9及BCL2的mRNA水平的变化：调整细胞数为5×106-1×107cells，Trizon法提取RNA，常规方法进行逆转录，荧光定量qPCR测定基因表达水平。

2 结果

2.1 维瑞肽多西紫杉醇对HL60细胞增殖抑制作用的影响：HL60细胞经不同浓度（DTX）2-VRT和多西紫杉醇 （5x10-8 mM至5 mM）处理后48 h后，根据公式计算的细胞的增殖抑制率計算IC50， （DTX）2-VRT对HL60细胞作用后的IC50为0.001906μm。

2.2 流式检测偶合物对HL60细胞周期的影响

PI标记后经流式细胞仪检测结果显示，对照组HL60细胞是G1期比例为21.4%，经不同浓度的（DTX）2-VRT（0.0001906μm，0.001906μm，0.01906μm）作用48h后，HL60细胞G1期比例升高，分别为 31.24%、34.8%、46.34%。

2.3 qPCR检测在多西紫杉醇维瑞肽偶合物作用下HL60细胞中mTOR通路相关分子PI3、AKT、mTOR分子mRNA水平的变化

图1所示，HL60细胞经不同浓度的（DTX）2-VRT（0.0001906μm， 0.001906μm，0.01906μm）作用48h后，PI3K、AKT、mTOR分子mRNA水平都是明显下降的，推测（DTX）2-VRT可以通过抑制mTOR通路抑制HL60的细胞的增殖。

3 討论

化学抗癌药因自身弱点而产生毒副作用，是癌症难以治愈的重要原因之一，多西紫杉醇（DTX）也不例外[1-2]。众多研究表明，肿瘤细胞可高密度表达正常细胞不具有的某些特殊受体，针对这些特殊受体及可选择性与受体结合的靶向多肽开展研究而发展起来的分子靶向抗癌治疗策略。维瑞肽 （Vapreotide，VRT）是在对内源性靶向多肽生长抑素进行结构修饰及调整的基础上，通过化学合成而得的高效靶向多肽之一[3-4]。维瑞肽偶联的化疗药物是增加抗肿瘤靶向性的重要技术方向。

本项目中所采用的创新技术将抗癌药物多西紫杉醇DTX与小分子靶向多肽维瑞肽相结合，合成多西紫杉醇-维瑞肽偶合物。结果表明维瑞肽多西紫杉醇可抑制HL60细胞增殖，G0/G1期延长，S期缩短。PI3K、AKT、mTOR分子mRNA水平都是明显下降。初步证明维瑞肽多西紫杉醇具有明显抑制HL60细胞的增殖的作用，并与PI3K、AKT、mTOR分子mRNA水平表达下降有关。

参考文献

[1]Bisserier M， Wajapeyee N.Mechanisms of resistance to EZH2 inhibitors in diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 2018 Mar 23. pii： blood-2017-08-804344.

[2]Liu Y， Li Y， Ou Q， Wu X， Wang X， Shao YW， Ying J.Acquired EGFR L718V mutation mediates resistance to osimertinib in non-small cell lung cancer but retains sensitivity to afatinib.Lung Cancer. 2018 Apr;118：1-5.

[3]Feng Q， Yu MZ， Wang JC， Hou WJ， Gao LY， Ma XF， Pei XW， Niu YJ， Liu XY， Qiu C， Pang WH， Du LL， Zhang Q.Synergistic inhibition of breast cancer by co-delivery of VEGF siRNA and paclitaxel via vapreotide-modified core-shell nanoparticles.Biomaterials. 2014 Jun;35（18）：5028-38.