青蒿虎酯对大鼠睾丸扭转复位后缺血再灌注损伤的影响

王磊 翁小东 陈志远 刘修恒

[摘要] 目的 探讨青蒿虎酯对大鼠睾丸扭转复位后缺血再灌注损伤的影响。 方法 采用随机数字表法将18只成年健康雄性SD大鼠分为对照组、缺血组和青蒿虎酯组，每组6只，建立睾丸扭转复位动物模型（720°维持2 h）。青蒿虎酯组于术前3 d灌胃青蒿琥酯25 mg/（kg·d），对照组和缺血组灌胃同体积蒸馏水。复位后4 h处死大鼠并获取睾丸组织，分别检测组织丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）含量，采用HE染色和TUNEL染色检测组织病理学参数和生精细胞凋亡指数（AI）。Western blot检测各组睾丸组织多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）-1和凋亡诱导因子（AIF）的表达。 结果 与对照组比较，缺血组和青蒿虎酯组SOD活性和曲细精管直径明显降低，而MDA含量、凋亡指数、PARP-1和AIF表达则显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;与缺血组比较，青蒿虎酯组SOD活性和曲细精管直径显著升高，MDA含量、凋亡指数、PARP-1和AIF表达明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 青蒿虎酯对睾丸扭转复位后的缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能是通过抑制细胞凋亡和氧化应激表达而实现。

[关键词] 青蒿虎酯;睾丸;扭转;缺血

[中图分类号] R697.22          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（b）-0018-04

睾丸扭转是泌尿外科的常见急症之一，多发生于青少年[1]。发生扭转的睾丸必须在6 h内复位恢复血供，否则发生扭转的睾丸生精细胞会发生不可逆性的细胞损伤[2-3]。手术复位及时的患者，术后仍有可能出现扭转侧睾丸的生精功能下降，有的患者还会出现扭转侧睾丸萎缩、精子活力下降、数量减少等[4]，其机制与扭转侧睾丸复位后的缺血再灌注损伤密切相关[5]。青蒿琥酯是具有β-倍半帖内酯类青蒿素的衍生物，具有抗疟、抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能等多种药理作用[6-8]。近年来研究表明青蒿琥酯还具有减轻肾脏缺血再灌注损伤的作用，但对于睾丸缺血再灌注损伤是否有保护作用，目前报道较少。本研究旨在观察青蒿琥酯对睾丸缺血再灌注后的睾丸细胞损伤是否具有保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠18只（250～300 g），8～10周龄，SPF级，购自于武汉大学医学院实验动物中心（合格证号：42009800001176），造模前适应性喂养1周，室温19～23℃室内饲养，相对湿度60%，每日12 h光照，自由饮水、进食。动物实验方案经过武汉大学人民医院动物实验伦理委员会的批准。

1.2 试剂

青蒿琥酯：广西桂林南药股份有限公司（純度 >99%，批号：ZA080203）;多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）-1（sc-53643）、凋亡诱导因子（AIF）（sc-55519）抗体购于santacruz公司;BCA蛋白浓度试剂盒（P0012）购于碧云天生物技术研究所;超氧化物歧化酶（SOD）（A001-3）、丙二醛（MDA）（A003-1）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3 模型的建立与分组

采用随机数字表法将实验大鼠分为对照组、缺血组和青蒿虎酯组，每组6只。各组大鼠麻醉成功后取下腹切口，游离左侧睾丸并切断睾丸引带，分离至附睾头。对照组：将睾丸顺时针扭转720°后立即复位固定，关闭切口。缺血组和青蒿琥酯组：顺时针扭转720°并维持2 h，其间夹闭切口，后将睾丸复位固定，睾丸由暗红色变鲜红色代表造模成功。术前3 d灌胃青蒿琥酯25 mg/（kg·d），单次给药。对照组和缺血组灌胃同体积蒸馏水。

1.4 样本采集和处理

1.4.1 标本采集  各组大鼠复位4 h后处死，获取的睾丸组织一部分置于液氮中保存，另一部分用固定液固定，常规石蜡包埋后检测组织病理学改变和生精细胞凋亡指数。

1.4.2 SOD活力和MDA含量检测  获取各组大鼠睾丸组织后，取50 mg组织，加入0.9 mL生理盐水制成10%的组织匀浆。采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，邻苯三酚法测定SOD活性，具体操作步骤按照南京建成生物工程研究所的操作步骤进行检测[9]。

1.4.3 组织病理学检查  造模成功后，取各组大鼠的睾丸组织，用多聚甲醛固定后，依次脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡，行HE染色后，在200×光镜下观察其病理改变。通过检测曲细精管直径和生精细胞层数评价睾丸生精功能。曲细精管直径通过显微测微器检测;生精细胞层数通过90°、180°、270°和360° 4个方向计数生精细胞层数后得出平均值。

1.4.4 TUNEL法检测细胞凋亡  TUNEL染色后光镜下观察，胞核呈棕黄色者为凋亡阳性细胞，随机选取5个视野，在200×光镜下计数凋亡阳性细胞，凋亡指数为凋亡阳性细胞数占总细胞数的百分比。

1.4.5 Western blot检测PARP-1、AIF的表达  从-80℃冰箱中取出保存后的睾丸组织，BCA试剂盒计算各组蛋白浓度，取40 μg蛋白上样，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳、转膜、封闭后，后加入1∶1000稀释的PARP-1、AIF抗体，4℃下孵育过夜。之后与相应二抗（1∶2000稀释）结合，洗膜后ECL法显色、照相。

1.5 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各組大鼠睾丸SOD活性、MDA含量比较

缺血组和青蒿虎酯组睾丸SOD活性显著低于对照组，而MDA含量显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）;青蒿虎酯组SOD活性明显高于缺血组，MDA含量则明显低于缺血组，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 各组大鼠睾丸血清曲细精管直径、生精细胞层数和凋亡指数比较

与对照组比较，缺血组和青蒿虎酯组睾丸曲细精管直径变小，生精细胞细胞排列紊乱，细胞层数及数量减少，生精阻滞，凋亡指数升高（P < 0.05）。与缺血组比较，青蒿虎酯组睾丸曲细精管直径变大，生精细胞细胞层数增多，凋亡指数下降，差异均有统计学意义（P < 0.05），青蒿虎酯可改善睾丸缺血再灌注所致的曲细精管和生精上皮细胞的病理学损害

2.3 各组大鼠PARP-1、AIF表达比较

缺血组、青蒿虎酯组PARP-1、AIF表达明显高于对照组，青蒿虎酯组PARP-1、AIF表达显著低于缺血组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

睾丸扭转造成的损伤是不可逆的、最终会导致不育[10]。睾丸扭转后的复位过程是典型的缺血再灌注损伤过程，期间发生生精细胞能量代谢障碍、氧自由基损伤、炎症递质和基因转录异常[11]。正常机体的活细胞中均可产生氧自由基，而氧自由基的过量释放会对机体产生危害。正常情况下机体存在的抗氧化防御系统可以清除氧自由基及其代谢产物，而当氧自由基过量生成时，体内平衡就会被破坏[12-13]。睾丸扭转后抗氧化酶系统遭受损伤，而再灌注过程会产生大量的氧自由基，其通过直接损害或者一系列过氧化链式反应，会引起睾丸细胞结构的广泛破坏[11]，因此，清除睾丸内的氧自由基对减轻氧化损伤至关重要。

使用药物清除活性氧可以作为睾丸外科手术的有效补充[14-15]。之前的研究结果已证实多种抗氧化剂在动物睾丸扭转复位模型中具有减轻缺血再灌注损伤的作用，但是真正能用于临床的却并不多[16-18]。青蒿琥酯是具有β-倍半帖内酯类青蒿素的衍生物，具有治疗疟疾、病毒、肿瘤以及调节机体免疫功能等药理作用[19]。本研究沿顺时针方向扭转大鼠左侧睾丸720°，2 h后复位，建立睾丸缺血再灌注损伤。与对照组比较，缺血组睾丸SOD活性明显降低，MDA含量显著升高，而应用青蒿虎酯可以升高因缺血降低的SOD水平，降低因扭转缺血升高的MDA含量，提示青蒿虎酯可通过清除氧自由基及增加抗氧化能力而有效改善睾丸扭转造成的生殖细胞损伤。

本研究利用睾丸扭转复位模型来研究青蒿虎酯对睾丸缺血再灌注损伤的保护作用。笔者发现睾丸扭转复位期间的缺血再灌注损伤会造成生精小管明显萎缩和生精上皮细胞减少，间质明显水肿及出血。另外，本研究发现睾丸扭转复位后可以诱导生精细胞凋亡，与对照组比较，凋亡指数明显升高，而青蒿虎酯可以明显缓解睾丸缺血再灌注后的生精细胞形态学改变，并显著降低凋亡指数。在凋亡过程中，PARP-1被切割为两个片段，使细胞内的ATP不会被PARP-1的功能活动所耗竭，保证能量供应[20]。但是，PARP-1并非被动参与细胞凋亡过程，其过度激活可促进AIF的释放，引起Caspase途径依赖的细胞凋亡过程。本研究结果显示，与对照组比较，缺血组和青蒿虎酯组PARP-1和AIF表达显著增高，差异有统计学意义（P < 0.05）。而与缺血组比较，青蒿虎酯组上述指标的表达又显著下降（P < 0.05）。提示青蒿虎酯预处理可通过调节PARP-1/AIF通路的表达，从而抑制睾丸细胞凋亡，这与本研究TUNEL实验的检测结果相一致，提示青蒿虎酯预处理具有保护睾丸缺血再灌注损伤的作用。

综上所述，青蒿虎酯对睾丸缺血再灌注后的生精能力具有保护作用，其机制可能是通过抑制PARP-1/AIF通路表达而实现的，提示青蒿虎酯可作为一种治疗睾丸缺血再灌注损伤的有效药物实际运用于临床。

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（收稿日期：2018-07-26  本文编辑：张瑜杰）