福建牡蛎新基因SMRP1的功能分析

杨丙晔，李莹，陈仲巍，*

（1.厦门医学院厦门市医用海洋天然产物与细胞工程重点实验室，福建 厦门 361023；2.厦门大学海洋与地球学院，福建 厦门 361005）

基因的表达在个体发育的不同阶段以及不同的组织甚至细胞类型中是不同的，也叫基因表达的时空差异[1]。对一个基因的时空表达谱进行研究分析，是研究一个未知基因功能的基础，原位杂交技术从1969年创立以来已经分化成两个大的方面的应用，整体原位杂交和组织切片原位杂交。整体原位杂交主要用于检测特定基因在生物体的不同发育时期表达位置的分析，组织切片原位杂交主要用于检测基因在生物体的组织或细胞中的特定位置的表达分析，两者可以相辅相成地对基因表达特异器官或组织定位进行分析，进而将基因的功能与生物体的发育过程相联系[2]。定量即时聚合酶连锁反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）主要有半定量 RT-PCR，实时定量RT-PCR 和竞争性定量RT-PCR 3 种，其中实时定量RT-PCR 以其特异性强和自动化高的特点得到广泛的应用[3]。本研究利用实时定量RT-PCR 对SMRP1 在福建牡蛎不同发育阶段幼体和不同组织器官的特异性表达进行研究，继而用原位杂交技术对福建牡蛎不同发育阶段幼体和高表达组织中进行定位研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

荧光定量Mix：美国Thermo 公司；反转录试剂盒：日本TaKaRa 公司；TRIzol 试剂、抗地高辛抗体：美国Roche 公司；NBT/BCIP 显色试剂盒：中国索莱宝生物公司。

Gemini AS 自动组织脱水机、ASP300S 自动染色机：Thermo Fisher；EG1140 石腊包埋机、RM2235 轮转式切片机：Leica；YKN-ECA-FZ01 杂交炉：Midwest；BX53多功能显微镜：Olympus。

1.2 SMRP1基因在牡蛎幼体不同发育时期转录组文库表达分析

通过对福建牡蛎幼体5个不同时期的转录组文库比对分析获得SMRP1 基因序列。使用Bioedit 软件，从实验室构建获得的福建牡蛎幼体5个不同时期的转录组文库数据中搜索SMRP1 基因的有效序列，依据SMRP1 基因在转录组文库中的有效序列制作SMRP1 基因在福建牡蛎幼体6个不同发育时期的表达图。

1.3 SMRP1基因在牡蛎幼体不同发育时期和不同组织的qRT-PCR表达分析

从育苗场分别获得6个不同时期的福建牡蛎幼体：担轮幼体、D 形幼体、壳顶幼体、眼点幼体、附着变态幼体和稚贝，将幼体集中收集到培养皿中，在培养皿中逐滴加入1 mol/L 的MgCl2溶液，并且不时的在显微镜下观察，发现幼体从浮游状态到沉到底部且组织器官没有活动迹象时，将幼体收集到1.5 mL 的离心管中，将含有MgCl2的海水尽量吸取干净，加入4%的多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA））。每个时期幼体取3组平行样品。从厦门市第八市场获取新鲜捕捞的福建牡蛎成体，解剖后获得牡蛎7 种不同组织样品，每个组织样品获取3个平行样品。样品加入TRIzol 试剂，依据TRIzol 试剂提取的方法提取不同样品的总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），ND-1000 测定 RNA 的浓度。使用TaKaRa 公司的反转录试剂盒，以1.5 μg 总RNA 作为反转录模板，制备不同发育时期和不同组织的互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）文库，设计 SMRP1 基因特异性引物（表1），以反转录产物稀释10 倍为模板，18S 核糖体RNA为内参基因，用ABI7500 热循环仪检测SMRP1 基因在福建牡蛎幼体不同发育时期的表达变化[4]。荧光定量的数据处理采用公式：N=2-ΔCt(Ct-18)（Ct 代表荧光定量热循环仪所采集到循环数）。

不同发育阶段的表达数据比较采用SPSS 软件分析差异。

表1 引物序列Table 1 List of primers sequences

1.4 SMRP1基因在福建牡蛎鳃和外套膜中的表达定位分析

利用设计的SMRP1 基因特异性引物（表1），PCR扩增获得429 bp SMRP1 基因片段，将429 bp 的片段克隆到PGEM-T EASY 载体中，测序确定PGEM-T EASY 载体中SMRP1 基因拍片段的正确性，利用克隆好的PGEM-T EASY 载体为模板，扩增获得带有T7 和SP6 启动子序列的DNA 片段。使用DIG-RNA labeling Kit 试剂盒获得SMRP1 基因的特异原位杂交探针。

切片原位杂交：解剖新鲜采购的福建牡蛎成体，获得鳃和外套膜组织，将组织样品固定于4%的多聚甲醛溶液中，4 ℃固定过夜。磷酸缓冲液洗3 次，每次10 min，然后依次浸泡于25%、50%和75%乙醇溶液中各10 min。然后进行样品的透明和包埋。将包埋好的样品用组织切片机切片，切片的厚度为5 μL，切片展片于多聚赖氨酸包埋好的载玻片上，42 ℃烘烤3 h。然后参考牡蛎性腺切片原味杂交的方法[5]，对牡蛎鳃和外套膜进行表达定位试验。

红琴笑靥如花，像盅惑人的林中女妖。她的身上散发出一种奇异的幽香，与林中的草木的气息混合在一起，形成一种令人沉醉的芬芳。风一吹，树上有几片黄叶飘落下来。你真的要离开我？她问。他没有回答，以往总是她逃离茶庄，去山下的小村子。她做梦也没有想到，有朝一日他也会离开茶庄，离山下的红尘世界越来越远，直至像一朵云一样飘走。她害怕了，莫非他还要再次出家，重新皈依佛门，遁入空门去白云寺当和尚？如果真是这样，这一次他一定是看破了红尘，一定会受戒的。她突然大声尖叫起来，不，你不能走！我不让你走！

1.5 SMRP1基因在牡蛎幼体发育过程中的组织定位分析

从育苗场分别获得3个不同发育时期的牡蛎幼体：D 形幼体、壳顶幼体、和眼点幼体，取样方法参照文章1.3 部分，幼体4 %的多聚甲醛固定之后，分别用25%、50%、75%和100%甲醇脱水，每次5 min。最终在100%的甲醇中-20 ℃保存待用。整体原位杂交参照在海鞘生物中的试验方法[6]。

2 结果与分析

2.1 SMRP1基因在牡蛎幼体不同发育时期和不同组织的表达分析

通过比对分析福建牡蛎幼体5个不同时期的转录组文库获得SMRP1 基因序列。对获得的SMRP1 的核酸和蛋白序列的分析如图1所示，全长1 468 bp，编码396 氨基酸。核酸序列含有一个起始密码子和终止密码子，且在序列后部含有一个加尾信号。

利用不同发育时期的转录组文库分析SMRP1 在幼体不同发育阶段的表达情况，结果如图2所示，SMRP1 基因在牡蛎幼体的6个发育时期中眼点幼体、变态过程中和稚贝时期表达相对较高，尤其是在变态过程中表达最高。通过qRT-PCR 检测验证发现，SMRP1基因除了在变态前后时期和变态过程中表达很高之外，在壳顶的初期表达量也相对会高些。

图1 SMRP1基因的核酸和蛋白序列分析Fig.1 SMRP1 cDNA sequence and protein sequence analysis

图2 SMRP1基因组在不同发育时期幼体表达Fig.2 SMRP1 gene expression pattern during different development stages

2.2 SMRP1基因组织特异性表达分析

qRT-PCR 检测结果如图3所示。

图3 SMRP1基因在不同组织器官的表达结果Fig.3 SMRP1 gene expression pattern from different tissues

由图3可知，SMRP1 基因在牡蛎中具有明显的组织特异性。SMRP1 基因在外套膜和鳃组织中表达量明显高于其它组织，特别是在外套膜中的表达量尤其高。

2.3 SMRP1基因在鳃组织中的表达定位分析

利用组织原位杂交技术，获得SMRP1 基因在福建牡蛎鳃组织中的表达定位结果如图4所示。

图4 SMRP1 mRNA在鳃组织中的空间表达分析Fig.4 SMRP1 mRNAspatialexpression analysis in gill tissue

SMRP1 基因主要在福建牡蛎鳃主鳃丝的普通鳃丝外表皮细胞中，还有表达在瓣间连接的一些外表皮细胞上。

2.4 SMRP1基因在外套膜组织中的表达定位分析

利用组织原位杂交技术，获得SMRP1 基因在福建牡蛎外套膜组织中的表达定位结果如图5所示，SMRP1 基因主要表达在牡蛎外套膜组织边缘的外表皮细胞中。

图5 SMRP1 mRNA在外套膜组织中的空间表达分析Fig.5 SMRP1 mRNA spatial expression analysis in mantle tissue

2.5 SMRP1基因在幼体不同发育时期的组织定位分析

利用整体原位杂交技术，获得SMRP1 基因在牡蛎不同发育时期幼体中的表达分析结果如图6所示。

图6 SMRP1 mRNA在不同发育时期幼体空间表达分析Fig.6 SMRP1 mRNA spatial expression analysis in different development stages

SMRP1 基因从牡蛎壳顶幼体初期开始大量表达，且可以观察到SMRP1 基因在壳顶时期集中表达在身体中部偏壳开口的位置。幼体发育到眼点时期可以明显的观察到SMRP1 基因大量集中表达在外套膜的边缘位置。

3 讨论与结论

福建牡蛎是我国重要的海水经济养殖贝类，特别是在福建沿海地带，是牡蛎的主要养殖贝类，福建牡蛎是典型的滤食性动物，滤食性贝类鳃的作用非常重要，具有呼吸和摄食的双重作用[7]，海水被牡蛎吸入体内后，流经鳃组织，鳃丝上的纤毛一方面有过滤食物的作用，通过纤毛的运动将食物运到口处，另一方面的功能可以进行气体交换。所以鳃的生长与发育直接影响到牡蛎的生长发育。

通过对福建牡蛎幼体不同发育转录组库分析发现幼体附着变态时期高表达基因SMRP1，SMRP1 主要分布在牡蛎鳃的主鳃丝和普通鳃丝的上皮细胞里，这些柱状的上皮细胞具有非常重要的作用，他们通过控制自身上的纤毛来控制对食物的运送。SMRP1 基因还有一个主要分布区就是在瓣间连接上的扁平细胞里，瓣间连接是由2 排单层扁平细胞及其腔隙构成，腔隙内为含血腔的结缔组织。瓣间连接的扁平细胞区是牡蛎的呼吸上皮区[8-9]，是鳃丝与外界进行气体交换的部位。由此可见SMRP1 基因的主要表达在鳃组织的2 大功能区域。SMRP1 基因的功能是与生长发育密切相关的，可见SMRP1 基因对福建牡蛎鳃组织的生长和发育起着重要的作用，进而直接影响牡蛎进食和呼吸。

贝类外套膜组织形态学和组织化学方面的研究已经很多[10-11]，牡蛎的外套膜有左右2 片，每片由外侧上皮细胞、内侧上皮细胞和中央的结缔组织组成，外套膜的边缘分成3 部分，外层、中层和内层，外层称为生壳突起，主要功能是分泌贝壳，中层称为感觉突起对外界刺激反应灵敏，专司感觉作用；内层称为缘膜突起可以伸展和收缩，控制进水孔的通道，具调节水流的作用。外层壳侧的表皮细胞中含有大量的嗜碱性粒，推测是碱性磷酸酶的酶原粒，该酶是碳酸钙结晶的关键酶[12-13]，所以外套膜壳侧的表皮细胞对贝壳的生长具有重要的作用。而中层的感觉作用主要也是通过其突起的表皮细胞来完成的。跟生长密切相关的SMRP1 基因集中分布在外套膜的表皮细胞中，对外套膜表皮细胞生长的调节具有非常重要的作用。

综上所述，SMRP1 基因主要表达在外套膜和鳃的关键功能区域的表皮细胞中，对外套膜和鳃的生长发育具有重要的调控作用，从而直接影响了其组织功能的发挥。