索邦和西伯利亚百合的离体再生体系建立

崔均涛，刘凤民，张伟丽

（1.仲恺农业工程学院园艺园林学院，广东 广州 510225；2.仲恺农业工程学院教学科研基地，广东 广州 510225；3.仲恺农业工程学院农业与生物学院，广东 广州 510225）

【研究意义】 索邦（Sorbonne）和西伯利亚（Siberia）百合均属于东方百合杂种系，为百合中的名贵品种群，由于其花色丰富、气味芳香而深受人们喜爱，成为近年国内外市场热销的花卉种类之一，栽培面积也日益增长，在切花生产中的地位也越来越重要。百合主要靠分球繁殖，繁殖系数低，传统的鳞茎球繁殖方法繁殖速度缓慢，而离体培养繁殖速度快，有利于工厂化和规模化生产[1]。利用组织培养技术，既能脱毒、又能加快其生长发育周期，从而更好地利用其经济价值和开发其潜力[2]。【前人研究进展】 近年来，国内学者对多种百合进行离体培养研究[3-8]，随着东方百合在市场上越来越受欢迎，对东方百合的离体研究也逐渐增多[9-12]。龙彬等[13]研究表明，株洲红东方百合的组培苗在-1 ℃条件下冷藏40 d为最佳并有助于炼苗成功。农艳丰等[14]研究了东方百合甜梦品种花器官的组织培养，结果表明花器官中子房最容易诱导愈伤组织，花柱、花药次之，花托为最难诱导愈伤组织。目前东方百合的离体培养研究取得较大进展，如针对索邦，不同研究所报道的适宜培养基配方不同。梁芳等[15]认为，索邦百合最佳增殖培养基是MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，愈伤组织诱导最佳培养基是MS+IBA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，分化培养最佳培养基是MS+NAA 0.3 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+KT 0.2 mg/L；西伯利亚百合在MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L培养基中愈伤组织的诱导和增殖最佳，分化培养最佳培养基是MS+IBA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L；以上两个品种最佳生根培养基均为1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.01 mg/L。闫海霞等[16]研究表明，提伯（Tiber）、索邦和西伯利亚等3种东方百合愈伤诱导和分化的适宜培养基为MS，最适增殖培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，最适生根培养基为MS+IBA 0.1 mg/L。【本研究切入点】 目前东方百合的离体培养研究虽然取得较大进展，但是索邦、西伯利亚两种东方百合遗传转化再生系统研究仍较少[17-18]。【拟解决的关键问题】 确定索邦和西伯利亚百合的离体再生系统适合的诱导培养基、增殖培养基、生根培养基以及最佳转化受体系统，建立稳定、高效的索邦和西伯利亚百合的离体再生体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为索邦百合和西伯利亚百合的无菌鳞茎球，购自中国芊卉种苗公司。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体灭菌 取百合鳞茎球先经流水冲洗2 h，冲洗干净后把鳞片叶剥下，选取分化能力最强、与鳞茎盘相连的下部柔嫩鳞片叶，剔除菌斑及瑕眦；用75%酒精浸泡30 s、无菌水漂洗后放入0.1% AgCl2（0.02%吐温）中浸泡5～8 min，再用无菌水漂洗5次，滤纸吸干水分，切成3 mm×3 mm小块作外植体，背面朝下接种在培养基上。在人工控制培养室中培养，先暗培养7 d，培养温度 22～26 ℃，光照度 2 000～2 200 Lx，光照12 h/d。

1.2.2 愈伤组织及芽诱导培养基筛选 以MS为培养基，共设置11个不同的激素浓度组合，包括2,4-D（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）+6-BA 0.2 mg/L、2,4-D（1.0、1.5、2.0 mg/L）、6-BA（2.0、1.5、1.0、0.5 mg/L）+NAA 0.2 mg/L。然后附加蔗糖3%、琼脂0.55%～0.65%，pH调至5.8，培养120 d，观察其生长状况，60 d统计启动率，120 d统计植株出芽频率、有效外植体平均出芽数和出苗平均高度。

1.2.3 继代增殖培养基筛选 接种60～90 d后诱导培养基中已长出大量愈伤组织和芽丛，将愈伤组织和丛芽切割成0.5 cm×0.5 cm小块，接入附加有不同激素配比（包括2,4-D 1.5 mg/L、2,4-D 1.0 mg/L、6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L）的MS培养基上，定期观察两个品种在3个继代培养基中的生长状况，并统计芽增殖倍数、芽平均高度和生长势。

1.2.4 根诱导培养基筛选 将苗高3 cm以上且基部鳞茎球达到直径3 mm的无菌苗，移至附加不同激素配比（包括NAA 0.1、0.2、0.3 mg/L，IBA 0.1、0.2 mg/L）的1/2MS培养基中，40 d后统计生根数、根长和生长势。

1.2.5 炼苗移栽 待苗基部鳞茎球发育至直径达3 mm时，即可敞开瓶口在培养室中炼苗。1周后，用流动水清洗干净根系上的培养基，移入喷洒过0.2%达克宁的基质（沙∶花肥∶椰糠为1∶1∶1）中，温度为25 ℃，平均光照2 000 Lx，每天光照12 h，15 d后再移入花盆或大田中生长。

1.2.6 抗生素敏感实验 在获得最适合两种百合诱导增殖生根培养基的基础上，设5个卡那霉素浓度梯度（0、50、75、100、150 mg/L）。30 d后统计褐化率，观察发芽表现，筛选转化植株时卡那霉素的浓度。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对百合愈伤组织诱导的影响

百合鳞片块接入培养基中约15 d左右，鳞片颜色由白色变成绿色，接种20 d时鳞片表面及切口处出现白色及浅绿色突起，即出现了黄绿色愈伤组织，主要集中在不定芽上。每个鳞片上有数个突起，接种40～45 d时突起部位长出绿色芽丛，且鳞片基部出现愈伤组织并逐渐增大，至接种70～80 d时芽丛继续长高，而基部愈伤组织在生长的同时又出现新的芽点及芽丛。继续培养至120 d，可确定培养基各阶段的诱导及伸长芽的效率。

从表1可以看出，接种60 d时，索邦和西伯利亚在H4、H5、H11培养基上的启动率均高于其他培养基，百合在各诱导培养基中的愈伤及芽生长情况见图1。接种120 d 时，在H1～H3等3种培养基中，两种百合的植株出芽频率和有效外植体平均出芽数均相对较低，甚至出芽数为0。在H4培养基中，索邦百合虽然植株出芽频率为100%，但其有效外植体平均出芽数较低。两种百合的植株出芽频率和有效外植体平均出芽数均相对较低，甚至出芽数为0。而H5、H6、H7培养基中百合的有效外植体出芽数均大于5且出芽频率都为100%，表明单独使用2,4-D效果更好。索邦在H5、H6培养基中长出鳞茎球，西伯利亚在H6、H7培养基中也长出鳞茎球。H11培养中，百合的各项测定指标均显著高于H8、H9、H10、H11等4种培养基。综上说明，索邦的最适芽诱导和伸长培养基是MS+2,4-D 1.0～2.0 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，西伯利亚的最适芽诱导和伸长培养基为MS+2,4-D 1.0～1.5 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

表1 不同激素配比对百合愈伤组织诱导的影响Table 1 Effects of different hormone ratios on callus induction of Lilium

图1 索邦和西伯利亚百合在不同诱导培养基中的愈伤组织及芽生长情况Fig.1 Callus and bud growth of Sorbonne and Siberia in different induction medium

2.2 不同激素配比对百合丛芽继代增殖的影响

由表2可知，在MS+2,4-D 1.5 mg/L培养基中，索邦和西伯利亚百合的增殖倍数最高、分别为2.76和4.51，且芽平均高度也最高、分别为5.03和5.17，但两种百合的长势均比MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养基中植株差。西伯利亚百合在MS+2,4-D 1.5 mg/L培养基中虽然分化出大量愈伤组织，但芽有畸形现象。而在MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养基中，百合苗较壮且没有畸形，芽与愈伤组织的密度也较合适。试验中还发现，两种百合培养一个周期后，西伯利亚百合在仅含有2,4-D的培养基中丛芽发生玻璃化现象，说明2,4-D对西伯利亚百合的抑制分化作用更明显。综合生长状况，我们认为在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，两种百合繁殖出的愈伤组织和丛芽更健壮、密度也更合适。

表2 不同激素配比对百合丛芽继代增殖的影响Table 2 Effects of different hormone ratio on subculture proliferation of Lilium cluster buds

2.3 不同激素配比对百合根诱导及移栽的影响

由表3可知，索邦和西伯利亚的根诱导培养基试验结果比较一致，在添加NAA 0.1～0.3 mg/L的MS培养基中，MS+NAA 0.2 mg/L中百合的平均根长度显著高于其他两种培养基，索邦和西伯利亚分别为1.13、3.70，平均生根数次于MS+NAA 0.3 mg/L培养基，且植株生长势好、根系粗壮。虽然MS+NAA 0.3 mg/L培养基中百合平均生根数最高，但是植株生长势相对于其他两种培养基较为弱。MS+IBA 0.1 mg/L培养基中百合的各项指标均显著高于MS+IBA 0.2 mg/L，且植株生长势好、根系粗壮。综合生根数、平均根长度和植株生长势，效果较好的生根培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L，IBA和NAA对促进百合生根效果相仿。

表3 不同激素配比对百合根诱导及移栽的影响Table 3 Effects of different hormone ratios on the rooting induction and transplanting of Lilium

2.4 卡那霉素抗性筛选

从表4可以看出，随着卡那霉素质量浓度的升高，两种百合褐化率上升、发芽数减少，外植体的生长和分化受到不同程度的影响。当卡那霉素质量浓度较低时，两种百合发芽正常，当卡那霉素质量浓度为150 mg/L时，两种百合褐化率分别高达100%和98%，无芽发生且芽呈黑褐色。可见，卡那霉素质量浓度越高，两种百合均表现为发芽减少并呈萎缩趋势，150 mg/L浓度能起到抑制未转化细胞的效果。

表4 百合鳞片对卡那霉素的抗性Table 4 Resistance of Lilium scales to Kanamycin

3 讨论

3.1 不同激素配比对百合丛芽的影响

通过对索邦和西伯利亚百合离体快繁结果表明，在促进愈伤组织的诱导、继代增殖、生根培养中，生长调节剂的选择及其浓度都会影响芽的生长。同时发现索邦和西伯利亚在添加2,4-D的MS培养基中出芽效果更好，说明在适宜浓度下单独使用2,4-D比组合使用6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L对百合丛芽持续生长的效果更明显，但其综合生长状况却不及组合激素发挥稳定。因此，单独使用2,4-D对百合分化芽的生长状况比再加入6-BA强，这与前人试验结果[19]相一致。在组合激素培养基中百合幼苗更加健壮，不易发生玻璃化现象。此外，本试验还观察到的6-BA在愈伤组织分裂中的作用，6-BA浓度过高（2.0 mg/L）会导致百合出苗长势变差，相对适宜的6-BA浓度为0.5 mg/L。我们认为，6-BA和NAA在百合增殖和生根中的作用是协同的，任意一种浓度过高或过低后会导致植株生长不良，两者比例合适时才能发挥最大效果。

3.2 百合转基因研究、抗生素对百合的敏感影响

目前，采用农杆菌介导法进行百合转基因研究中，大多采用的是在室外生长的鳞片叶进行消毒，然后与农杆菌共同培养[20]，此法的最大缺点是污染率高，表面消毒对供试材料具有一定伤害，从而造成褐化，最终导致转化率降低。而本研究采用组织培养的方式，将鳞片叶直接作为基因转化受体材料，建立直接分化再生系统，此法的优势在于取材不受季节和气候的影响，且没有外植体污染问题，从而提升了转化效率。

唐东芹等[21]认为，在基因转化过程中百合外植体不能连续被分割，且在筛选培养基时抗生素会使有切口的外植体褐化并导致死亡，因此要保证外植体的完整性。说明百合再生能力强且适合离体培养，若以鳞片为外植体，其直接分化率高、分化周期短且分化能力强，是外植体稳定来源之一卡纳霉素的使用能有效抑制非转化细胞或细菌的生长，并且不影响转化细胞的生长效果，但转化筛选时必须保证外植体的完整性，防止伤口恶化。鳞片叶再生过程中，NAA和6-BA组合对鳞片叶再生效果好，且分化率高，可作为良好的受体。

4 结论

本研究以百合鳞茎片为外植体，比较了不同诱导培养基、增殖培养基、生根培养基的诱导、继代增殖、生根效果。结果表明，索邦百合的最佳诱导培养基是MS+2，4-D 1.5～2.0 mg/L，西伯利亚百合是2，4-D 1.0～1.5 mg/L；两种百合的最佳继代培养基均为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，最佳生根培养基均为1/2MS+NAA 0.2 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L。以百合鳞茎片为受体系统而筛选转化植物时，卡那霉素最佳质量浓度为150 mg/L。本研究确定了两种百合的离体再生体系的技术参数，诱导培养开始7 d为暗培养，诱导培养基中培养60～90 d后，分割芽丛或新形成的小鳞茎片后接入继代培养基中继代45 d，再生根培养40～50 d，当芽苗高度达3 cm且新形成鳞茎球直径达3 mm时，炼苗7 d，然后移至基质（沙∶花肥∶椰糠为1∶1∶1）生长15 d后移入花盆或大田中生长。本研究结果可为东方百合品种种球工厂化生产及遗传转化再生体系提供充实理论依据。