省沽油叶枯病病原菌的分离鉴定及药剂筛选试验

陈嘉敏，郭茂超，朱志强，罗美林，魏 蜜

（1．湖北工程学院生命科学技术学院/特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北 孝感 432000；2．湖北大学生命科学学院，湖北 武汉 430062）

【研究意义】 省沽油（Staphylea bumalda）是我国珍稀的木本油料，主要分布于浙江、江西、云南等省，现在北京及其以南地区也已广泛栽培，花白如雪，给人以清新淡雅之感，在园林绿化中应用广泛，是鄂北地区的特色经济作物，具有种植投入少、管理技术简单、适种范围广泛、经济收益丰厚、劳动强度适中等优点。因此，人工种植省沽油日渐成为农民增收的重要渠道，并成为精准扶贫、产业扶贫的优质项目被多地基层政府在贫困山区广泛推广。同时，省沽油也是一种天然野生食品，其嫩叶和花朵具有很高的食用和药用价值，被用作止咳药、止泻药和产后血液清凉剂等[1]，且能够降低血脂和胆固醇浓度，调节血压，减少老年痴呆症、癌症及许多心血管类疾病的发生，提升人体免疫力等，在开发为保健食品上有较高的经济价值。此外，种子油含量和质量都很好。有研究发现，种子出油率可达30%左右[2]，

其嫩叶、嫩梢和花蕾中含有丰富的不饱和脂肪酸、维生素、粗蛋白、总氨基酸和必需氨基酸等营养成分[3]，具有广泛的应用前景。而2017年6月，省沽油叶枯病在湖北省孝感市农科院试验园被发现，其发病率约为30%。受害叶片从叶尖开始发病，随后延伸至中部甚至整个叶片，在大规模种植条件下该病害可能会普遍发生，对于省沽油工业的发展是一个潜在的巨大风险。【前人研究进展】 目前，国内还未见有关于省沽油病害发生的相关报道。【本研究切入点】 为防止该病害大面积发生，造成严重经济损失，对该病害病原菌进行分离鉴定及防治药剂筛选研究。【拟解决的关键问题】 通过对样品的采集、组织分离培养、致病性测定、形态学观察和分子生物学鉴定，明确了该病害的病原菌种类；并通过室内药剂筛选试验，为省沽油叶枯病综合防治措施提供一定的理论基础依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试省沽油叶枯病叶片和健康省沽油植株于2017年6月采自湖北省孝感市农科院试验园。供试药剂：30%三环·氟环唑悬浮剂，江苏丰登作物保护股份有限公司生产；30%烯酰·咪鲜胺悬浮剂，江苏辉丰农化股份有限公司生产；37%戊唑·咪鲜胺水乳剂，江苏省农垦生物化学有限公司生产；80%福·福锌可湿性粉剂，山东慧邦生物科技有限公司生产。马铃薯购于孝感当地超市，葡萄糖和琼脂购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）[4]：马铃薯200 g去皮切碎，沸水加热30 min，用纱布滤去马铃薯残渣，加水补足至1000 mL，加入20 g葡萄糖和18 g琼脂。马铃薯葡萄糖培养基（PD）则不加琼脂。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌分离及纯化 采用组织分离法[4]对采集的病害叶片进行分离，剪取3 mm×3 mm病健交界处的叶组织，用无菌水冲洗3次后，用0.1%升汞冲洗3 min，用70%酒精再次冲洗3 min进行消毒，再用无菌水冲洗3次后，移置PDA培养基平板上25℃恒温培养。将长出的菌落挑取边缘菌丝进行纯化，然后保存备用。

1.2.2 致病性测定 根据科赫氏法则对分离得到的纯化病原菌进行致病性测定。将病原菌置于PDA平板培养基上培养，待产生大量孢子后，加入无菌水冲洗，收集孢子悬浮液；选择健康的省沽油叶片，叶片用70%酒精表面消毒后，将孢子悬浮液（1.0 × 106个孢子/mL）进行喷雾接种，以喷洒无菌水为对照。接种后14 d观察叶片发病情况，并拍照记录。从接种的有症状的叶子中再次重新分离出真菌鉴定。

1.2.3 病原菌鉴定

（1）病原菌形态学鉴定：将纯化的病原菌接种于PDA 培养基上，于25℃恒温培养箱中培养7 d 后观察菌落形态。培养至产孢后在荧光倒置显微镜下观察分生孢子的形态，选取50～100个分生孢子测量其大小取平均值。根据上述特征进行形态学鉴定。

（2）病原菌分子生物学鉴定：参照申光辉等[5]的实验方法略作改动，获得该病原菌的基因DNA，选用ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-3′）为引物进行PCR扩增，反应条件：94℃变性4 min；94℃变性30 s；55℃退火30 s、72℃延伸1 min，33个循环；最后72℃延伸10 min。得到产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后，送往天一辉远生物科技有限公司进行测序，测序结果在NCBI网站通过BLAST进行同源性比较，用MEGA 6.0构建系统发育树。

（3）病原菌脂肪酸鉴定：参照Fernandes等[6]的方法略作改动，将病原菌菌落用沙氏葡萄糖琼脂培养基（于青岛海博生物技术有限公司购买）培养，使用脂肪酸提取剂（皂化试剂、甲基化试剂、萃取试剂和洗涤试剂，美国Fisher公司提供）对待测微生物进行脂肪酸提取，提取的脂肪酸通过全自动微生物鉴定仪进行分析鉴定，结果通过微生物细胞脂肪酸成分鉴定软件MIS4.5（microbial identification system）和LGS4.5（library generation software）保存记录，并与数据库中标准菌种的脂肪酸信息进行比对。

1.2.4 室内药剂筛选试验 将已灭菌的PDA培养基溶解，待降到适宜温度后，按照试验设计（表1）加入药剂混合均匀倒入灭菌培养皿（直径9 cm）中，配成对应浓度的含杀菌剂平板，取新鲜病原菌用6 mm打孔器打取菌饼接种于平板中央，以不加杀菌剂的PDA为对照，每个浓度处理3次重复，每个重复1皿，25℃恒温培养7 d后，用十字交叉法测量菌落直径，计算试验药剂对病原菌生长的抑制率[7]，将抑制率转换为几率值[8]（y），求出供试药剂浓度的对数值（x），用EXCEL建立毒力回归方程式[9]，求出EC50。

表1 供试药剂试验浓度Table 1 The concentration of selected fungicides

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离纯化及致病性测定

用分离纯化的病原菌喷雾接种的省沽油叶片（图1B，彩版见封三）从叶尖开始出现枯黄，随后延伸至中部甚至整个叶片，发病症状与田间自然发病的省沽油叶片（图1A）基本相同。而用无菌水喷雾的对照叶片（图1C）表现为健康状态；采取人工接种发病叶片的病健交界处进行病原菌分离培养，与最初分离的病原菌形态一致。根据柯赫氏法则，说明分离的病菌即为省沽油叶枯病致病菌。

图1 省沽油叶枯病症状、致病性试验结果及病原菌形态特征Fig.1 Symptoms of Staphylea bumalda leaf blight, results of pathogenicity and colony morphology on PDA medium

图1 省沽油叶枯病症状、致病性试验结果及病原菌形态特征Fig.1 Symptoms of Staphylea bumalda leaf blight, results of pathogenicity and colony morphology on PDA medium

2.2 病原菌形态学鉴定

观察在PDA平板上生长的分离纯化的病原菌，菌落颜色呈青灰色（图1D），在生长7 d后长满培养皿( 直径9 cm) 。在显微镜下观察，分生孢子呈倒棒状，串联成长链状，大小为3.5～15.8 μm×7.6～46.5 μm，有 2～10个横隔膜和 0～3个纵斜隔膜（图1E、F）。根据病原菌的形态特征初步鉴定该病害是由互隔交链孢霉（A.alternate）真菌引起的。

2.3 病原菌分子生物学鉴定

病原菌的rDNA-ITS 区域经PCR扩增产物，获得了590 bp 左右的碱基序列，将该序列提交至GenBank（登录号:MF614038） 。利用 BLAST 搜索，用MEGA 6.0构建系统发育树。进行同源性比较，发现与A.Alternate MG569550菌株的ITS序列相似度达99%（图2）。结合病原菌的形态特征及ITS序列分析，确定该病害病原菌为互隔交链孢霉（A.alternate）。

图2 病原菌ITS聚类分析结果Fig.2 Dendrogram of cluster analysis on pathogen constructed based on rDNA-ITS sequences

2.4 病原菌脂肪酸鉴定

根据全自动微生物鉴定仪匹配结果，依据Buyer等[10]的原则：相似度（similarity index，SI）是指待测菌株与系统谱库中的标准菌株数值的匹配程度。相似度＜0.2，结果不可用。通过表2脂肪酸鉴定结果与2.3鉴定结果相互验证，发现与A.alternate最相似，相似度为0.517。

表2 供试病原菌菌株脂肪酸鉴定结果Table 2 Results of fatty acid identification of tested pathogen strains

2.5 室内药剂筛选

由表3可知，供试的4种杀菌剂对省沽油叶枯病的生长都有抑制作用。其中杀菌剂37%戊唑·咪鲜胺水乳剂EC50最低，为0.400 4 μg/mL，其抑菌效果最好，在药剂包装推荐使用浓度基础上稀释50倍，其相对抑菌率达78.5%，在推荐使用浓度基础上再稀释5 000倍，仍有抑菌作用，抑菌率达42.8%。其次是30%烯酰·咪鲜胺悬浮剂和80%福·福锌可湿性粉剂，EC50分别为1.461 9、1.756 2 μg/mL，抑菌效果较好，30%烯酰·咪鲜胺在药剂包装推荐使用浓度基础上稀释10倍，其相对抑菌率达83.7%；80%福·福锌在药剂包装推荐使用浓度基础上稀释20倍，其相对抑菌率达82.2%，两者同时在推荐使用浓度基础上再稀释4 000倍，也仍有抑菌作用，抑菌率达39%。最后是30%三环·氟环唑悬浮剂，EC50为6.055 9 μg/mL，该药剂在推荐使用浓度基础上稀释20倍，抑菌率达75.8%，在推荐使用浓度基础上再稀释1 000倍，抑菌率达38.4%，相较于37%戊唑·咪鲜胺、30%烯酰·咪鲜胺和80%福·福锌抑菌效果较差。

表3 不同杀菌剂对病原菌的毒力Table 3 Toxicity of different fungicides on the pathogen

3 讨论

链格孢属（Alternaria alternate）是一种全球常见的半知菌暗色丝孢菌，遍布自然界和人类居住的室内环境中，95%以上的种类兼性寄生于植物上。可引起冬枣黑腐病[11]、鸭梨黑斑病[12]、葡萄穗轴褐枯病[13]等水果病害；同时，链格孢属真菌还广泛寄生于农作物，引起甜瓜[14]、马铃薯[15]、大豆[16]、西葫芦和南瓜[17]等数十种作物的病害，以及柚木[18]、冬青卫矛[19]和单叶蔓荆[20]等园林植物病害，给国内外农业和水果产业造成重大经济损失。美国曾报道由瓜链格孢（A.cucumerina）和茄链格孢（A.dauci（Kuhn）Groves et Skolko f.sp.solani）引起的叶斑病和大豆猝倒病极度限制了美国甜瓜和西葫芦等的种植，使伊利洛斯州的大豆产量损失15%。在我国，葱链格孢（A.porri）引起的大葱紫斑病限制我国葱的出口，造成经济损失达5 000万元[21]。因此，为避免省沽油在产业化种植中出现该病害浸染，对该病害的鉴定及初步防治研究十分必要。

4 结论

本研究通过田间调查和采集样品，使用柯赫氏法则进行致病性测定，并利用形态学观察、分子生物学和脂肪酸鉴定，明确了省沽油叶枯病的病原菌为互隔交链孢霉（A.alternate）。经过查阅国内文献发现，由A.alternate引起的省沽油叶枯病为国内首次报道。同时为了避免该病害发生时盲目使用杀菌剂，对该病害进行室内防治药剂筛选，结果发现在供试药剂中，戊唑·咪鲜胺抑菌效果最好，EC50为0.4004 g/mL，其次是烯酰·咪鲜胺、福·福锌和三环·氟环唑。但室内药剂筛选结果由于采用平板打孔法测定，结果会受到药剂扩散能力与药剂产品批号等的影响，具一定局限性。因此，本试验测定结果只可为省沽油叶枯病的田间药剂防治试验提供借鉴基础。